簡介
當(dāng)需要持續(xù)獲得高質(zhì)量、高精確的數(shù)據(jù)時(shí)，那么迫切需要一臺全自動(dòng)基于細(xì)胞檢測實(shí)驗(yàn)的多參數(shù)分析系統(tǒng)。一臺緊湊的，全自動(dòng)微孔板圖像分析系統(tǒng)可用于多參數(shù)實(shí)驗(yàn)，如利用誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞 (iPSC) 分化為心肌細(xì)胞，神經(jīng)細(xì)胞和肝細(xì)胞研究中。多重參數(shù)包括細(xì)胞活力、細(xì)胞凋亡、線粒體膜電位和自噬等對于定義活細(xì)胞或固定細(xì)胞的毒性機(jī)制研究有著重要意義。同樣，我們展現(xiàn)出一些利用無標(biāo)記細(xì)胞分析方式來評價(jià)細(xì)胞毒性和細(xì)胞增殖情況的實(shí)例。展示利用新型自動(dòng)細(xì)胞成像分析系統(tǒng)進(jìn)行生物學(xué)研究和幾種實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒�立，這些都能夠?qū)�學(xué)術(shù)及生物制藥領(lǐng)域的研究具有巨大的促進(jìn)。

儀器
基于細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)的研究可利用 ImageXpress®Pico 自動(dòng)細(xì)胞成像系統(tǒng)結(jié)合 CellReporter-XpressTM 自動(dòng)圖像分析軟件。此系統(tǒng)在 4 色熒光通道成像的基礎(chǔ)上還可加入透射光成像和彩色成像功能，多種放大倍數(shù)物鏡可選，環(huán)境控制系統(tǒng) (EC)，注射器系統(tǒng)等，可以進(jìn)行時(shí)間序列形式的細(xì)胞增殖、分化、化合物毒性以及各種基于細(xì)胞學(xué)的實(shí)驗(yàn)。分析軟件采用新的邏輯運(yùn)算方法對目標(biāo)對象識別，簡化了分析流程，并可以提供多參數(shù)檢測結(jié)果。

方法
細(xì)胞培養(yǎng)：人類的 iPSC 分化的神經(jīng)細(xì)胞，心肌細(xì)胞或肝細(xì)胞購自于 Cellular Dynamics International,Fujifilm Co (CDI)，細(xì)胞預(yù)先以 10,000 每孔的密度鋪于黑色底透的 384 孔板內(nèi) (Greiner)，培養(yǎng)條件采用 CDI 推薦方法，Hela 細(xì)胞或 PC12 細(xì)胞 (ATCC) 培養(yǎng)條件采用廠家推薦方法，化合物處理于鋪板 24 小時(shí)后，繼續(xù)在此條件下培養(yǎng) 3 天，如圖中所示。細(xì)胞染色：評價(jià)表型改變，活細(xì)胞染色過程使用三種混合染料，活力染色使用 Calcein AM(1 μM)，線粒體膜電位染料使用 MitoTracker Orange (0.2 μM)，細(xì)胞核染料采用 Hoechst (2μM)，所有染料分子均來自于 Life Technologies，為了觀察肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架，細(xì)胞采用 4%多聚甲醛 (Sigma) 固定后使用連接有 AlexaFluor® 488 (AF488) 的鬼筆環(huán)肽進(jìn)行染色，神經(jīng)細(xì)胞染色采用連接有 anti-TuJ-1 抗體進(jìn)行染色。

評價(jià)細(xì)胞的形態(tài)和活力
成像和分析方法作為有效的工具可提供多種參數(shù)信息，包括細(xì)胞活力，細(xì)胞不同時(shí)期的特征，細(xì)胞粘附性和分布狀況，細(xì)胞骨架完整性( 形態(tài)學(xué) ) 和線粒體電勢變化等。

結(jié)果
特異性化合物對神經(jīng)細(xì)胞軸突生長影響
神經(jīng)細(xì)胞軸突生長表型變化 (iCell Gaba Neurons，CDI) 通過多重檢測手段來定量分析其神級細(xì)胞復(fù)雜程度，我們進(jìn)行多次檢測并且測試了幾種已知的神級毒性化合物作用效果。神級細(xì)胞軸突生長發(fā)育特征通過其生長程度進(jìn)行評價(jià) ( 總的長度或者每個(gè)細(xì)胞的平均長度 )，神經(jīng)軸突數(shù)目 ( 軸突的總數(shù) )，分支的延伸程度 ( 總的分支數(shù)目和每個(gè)細(xì)胞的平均分支數(shù)目 )。

評價(jià)化合物對心機(jī)細(xì)胞毒性的作用
評價(jià)心肌細(xì)胞毒性影響，使用各種不同的心肌細(xì)胞毒性化合物處理 24 小時(shí)，然后活細(xì)胞通過 Hoechst 核染料分子標(biāo)記后，MitoTracker Orange 染料標(biāo)記和 AF-488 連接的鬼筆環(huán)肽染料來檢測細(xì)胞骨架的完整性。利用 ImageXpress Pico 細(xì)胞成像系統(tǒng)獲取圖像，分析過程采用Cell Scoring 邏輯算法檢測總的熒光面積和平均的心肌細(xì)胞熒光面積，以及具有完整細(xì)胞骨架的細(xì)胞所占的百分比。

肝細(xì)胞表型變化
iPSC 誘導(dǎo)人肝細(xì)胞是非常有價(jià)值的細(xì)胞模型，可以表現(xiàn)出于原代肝細(xì)胞同樣的表型和功能，降低了變量因素和其它原代細(xì)胞限制條件后，自動(dòng)成像系統(tǒng)能夠幫助獲取并分析化合物對肝細(xì)胞毒性影響結(jié)果

線粒體膜電位變化和自噬實(shí)驗(yàn)
自噬功能紊亂和線粒體完整性與各種疾病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，包括神經(jīng)退行性疾病和心血管疾病，因此，通過這一個(gè)過程開發(fā)新型制劑已經(jīng)成為藥物治療最有前景的新方法。PC12 成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞系被作用于這些實(shí)驗(yàn)的模型細(xì)胞。。

利用透射光進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和凋亡檢測
分析軟件能夠無需借助于任何染料分子而進(jìn)行細(xì)胞分割和計(jì)數(shù)，這個(gè)應(yīng)用尤其對觀察一段時(shí)間內(nèi)細(xì)胞的增殖和細(xì)胞死亡非常重要。此外，我們可以通過熒光染料分子標(biāo)記細(xì)胞后來描述其細(xì)胞的凋亡過程。

總結(jié)
我們利用不同細(xì)胞類型展示了幾種多參數(shù)分析方式，包括 iPSC 誘導(dǎo)人的心肌細(xì)胞，神經(jīng)細(xì)胞和肝細(xì)胞。獲得多參數(shù)能夠更好的區(qū)分描述不同細(xì)胞類型和化合物作用效果。此實(shí)驗(yàn)全面的展示了 ImageXpress Pico 自動(dòng)細(xì)胞成像系統(tǒng)和 CellReporterXpress 軟件可在基于細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)應(yīng)用方面。