一、簡介

靶向細胞的科研研究和藥物研發避免不了細胞活力的分析和追蹤。但依據實驗的最終目的和關注參數的不同，細胞活力的體現，檢測方法也會不一樣。例如細胞增殖檢測適用于比較不同細胞株增殖能力，而細胞毒性分析則可以用于探究候選藥物是否有細胞毒性等。從分析儀器上來說，現階段主流的檢測平臺，如顯微鏡，流式細胞儀和實時熒光定量pcr儀等都可用于細胞活力的分析，但不同的平臺所關注的指標，靈敏度和通量會有所差異，因此需要依據所回答的生物學問題和指標選擇合適的檢測平臺。在上述平臺中，酶標儀提供了96、384孔板的高通量細胞活力檢測方法，靈敏度上能和經典的[3H]胸腺嘧啶摻入法(Thymidine Incorporation Assay)相媲美，因此成為了主流的科研和工業研發中細胞活力和毒性分析平臺。相應的，細胞活力分析也成為了酶標儀的基礎應用之一，也是Molecular Devices (MD)關注的主要應用。

 

在本手冊中，我們會從酶標儀出發向大家介紹，對比主流的細胞活力，毒性分析方法，并通過詳細的應用材料向大家展示如何應用MD酶標儀和軟件輕松，專業的完成細胞活力，毒性分析。
 

 

二、細胞活力分析

此部分主要關注常見的細胞活力分析方法，如MTT和ATP法等。雖然這些檢測方法也常用于分析藥物毒性和安全性，但相較于乳酸脫氫酶細胞毒性檢測等方法，它們更關注細胞活力的變化。依據原理的不同，細胞活力檢測方法主要分代謝法，酶活法和ATP法。

 

2.1 代謝法

2.1.1原理和介紹

代謝法是最常見的細胞增殖檢測方法，其主要包括四氮唑還原法(Tetrazolium reduction)，如MTT和CCK-8法等，和刃天青還原法(Resazurin Reduction)，如alamarBlue法等。這些方法的原理都是基于細胞的代謝能力還原孵育的底物，其產物通常具有光吸收或熒光屬性，因此能用酶標儀進行高通量細胞活力分析。

 

上述方法中，最常見的是MTT法，其屬于酶標儀光吸收應用，利用細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶對MTT的還原，形成不溶于水的結晶甲瓚(Formazan)并沉積在細胞中和細胞外。最后使用特定的有機溶劑，如二甲基亞砜(DMSO)等溶解后進行 570 nm處檢測[圖一]。由于MTT本身具有正電荷，因此容易進入細胞，并具有一定的代謝毒性。同時，確切上說，MTT法是檢測細胞線粒體的代謝活力。

圖一，MTT法原理，圖片來源于https://en.wikipedia.org/wiki/MTT_assay

 

近年來在MTT的基礎上一系列類似結構的底物被應用于細胞增殖活力檢測中，主要包括MTS, XTT, 和WST等，它們同樣屬于酶標儀光吸收應用。與MTT不同，這些底物本身具有負電荷，因此不易進入細胞，同時其還原產物可溶于水，因此無需溶解結晶步驟，提升了實驗的操作性和穩定性。該系列中，最常見的是基于WST-8的Cell Counting Kit-8(CCK-8法)。相較于僅依賴線粒體脫氫酶的MTT法，CCK-8法基于細胞內多數的脫氫酶，因此其檢測活力更為準確，靈敏度更高，同時降低了細胞毒性[圖二]。由于省去了溶解步驟，CCK-8法支持動力學檢測，提高了實驗的靈活性。同時因其毒性低，細胞在完成CCK-8法檢測后還可以用于后續的其他檢測。

圖二，CCK-8法原理，圖片來源于

 

上述的代謝法均屬于酶標儀光吸收應用，雖然相對經濟，但還是會受到光吸收本身的多種限制，尤其是動態范圍窄，容易受到具有光吸收特性的試劑和藥物干擾等。同時，光吸收法受限于比爾定律中的光徑因素，不適用于384或1536孔板等更高通量檢測等。因此，基于熒光檢測的代謝法也成為了主要的細胞活力檢測方法之一，其中常見的是基于刃天青還原的alamarBlue法。

 

原理上alamarBlue法與MTT和CCK-8法類似，利用增殖中的細胞固有的代謝能力進行還原無色，無熒光的刃天青，所得的紅色產物resorufin具有強熒光特性，因此可用支持熒光或光吸收的酶標儀進行檢測，提升了檢測的靈活性和抗干擾能力[圖三]。支持熒光檢測的alamarBlue法可具有3-4個動態數量級，具有更寬的檢測范圍和更高的靈敏度。同時，還原產物可溶于水，低毒，因此和CCK-8一樣支持動力學檢測和多重檢測。然而，alamarBlue法更為穩定，因此非常適合追蹤細胞的增殖變化。

 

圖三，alamarBlue反應前后的熒光(左，530-560 nm 激發)和光吸收變化(右)，圖片來自于Invitrogen 技術材料

 

2.1.2 Molecular Devices的支持

針對于代謝法MD主要提供硬件和軟件的支持，其中，硬件上配備光吸收的單功能和多功能酶標儀，如cMAX plus，Spectra-Max M系列等都支持MTT法和CCK-8法的高通量檢測。對應的，具有熒光檢測功能的酶標儀，如SpectraMax iD3/5，SpectraMax Gemini EM，SpectraMax i3X和M系列都推薦用于熒光法細胞活力檢測。軟件上，一方面Softmax Pro 7 模板庫中的Cell Growth &Viability已經預設了一些常用的方法模板，如alamarBlue法和MTS法。類似的方法只需在預設的模板上改變檢測參數即可，同時，修改后的模板可另存為新的模板方便后續的檢測。另外一方面，軟件支持多種形式的數據處理，包括雙波長矯正，空白扣除，數據均一化到后期的線性、四參數擬合等等，極大的簡便了分析過程，提高分析效率和一致性。

 

2.1.3 常見實驗流程和注意事項

代謝法的實驗流程基本一致，以MTT法為例[圖五]，主要分為以下幾個步驟。

a) 預鋪細胞于96孔板中，細胞密度需要根據細胞系本身和實驗目的(增殖活力還是藥物毒性篩選)進行優化。一般來說，懸浮細胞的密度要高于貼壁細胞。板型上光吸收法推薦透明板，熒光法推薦黑邊底部透明板。

b) 按照需求進行化合物或類似處理，此步的實驗需要優化藥物的起始處理時間和孵育時間，留意代謝法需要細胞代謝加入的底物，因此需要維持細胞在增殖階段進行下一步染色。此步中還需要留意對照的選擇和設置，包括系統對照（只有細胞或只有MTT染料加藥物等）和陽性對照(細胞毒實驗中溶劑處理組等)。

c) 進行底物孵育，此步需要優化底物孵育的時間和濃度。留意熒光法此步注意避光。

d) 溶解反應出的結晶，此步需要確保結晶的完全溶解，同時要確保溶解產物不影響最后的檢測，通常酸化的溶解會避免酚紅對最后檢測帶來的影響。CCK-8法和alamarBlue法無需此步

e) 應用酶標儀進行單波長或者雙波長檢測。一般MTT法單波長為570 nm，雙波長為 570 nm-630~690 nm 檢測，用于矯正細胞碎片或濁度干擾[圖五]。如果是熒光法，則按照推薦參數進行熒光檢測。CCK-8法和alamarBlue法此步可按需求進行動力學檢測。在進行動力學檢測時，推薦酶標儀先預熱至37°C。

處理和分析結果，相關的雙波長矯正，均一化和線性/四參數擬合等可在Softmax Pro軟件中自行完成。

 

代謝法的底物都是通過還原反應進行檢測，因此會受到具有還原能力的化合物和試劑的影響。此外，具有光吸收屬性和熒光屬性的化合物可能會影響光吸收法，如MTT法和CCK-8法和熒光法如alamarBlue法的檢測結果。對于上述影響，一方面可以通過直接混合化合物和底物檢測排除，一方面可通過其他的細胞活力檢測方法進一步分析。

2.2 酶法

2.2.1 原理和介紹

2.2.2 Molecular Devices的支持

2.2.3 常見實驗流程和注意事項

2.3 ATP法

2.3.1 原理和介紹

2.3.2 Molecular Devices的支持

2.3.3 常見實驗流程和注意事項

 

三、細胞毒性和殺傷分析

雖然上述的細胞活力分析方法被廣泛的用于毒性分析，但其從細胞活性的變化為出發點，不是直接的分析細胞毒性，同時，隨著免疫領域的興起，越來越多的研究開始關注直接的細胞毒性，尤其是細胞裂解情況的檢測。在此章中，我們會像大家介紹一些常見的，偏向由免疫細胞殺傷對應的毒性的檢測。

 

3.1 LDH 細胞毒性法

3.2 Calcein 釋放法

3.3 熒光素酶釋放法