介紹
蛋白質(zhì)的內(nèi)源熒光主要來源于芳香族氨基酸如色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸。在水中，色氨酸的最大激發(fā)光波長在270-280nm左右而其發(fā)射光波長峰值接近350nm。蛋白的發(fā)射光譜對(duì)溶劑的極性和外界環(huán)境十分敏感。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)變性時(shí)，色氨酸殘基會(huì)暴露在水中而其發(fā)射波長會(huì)變長。這種發(fā)射波長峰值的改變可以用來檢測蛋白質(zhì)的變性。在這里，我們將展示如何運(yùn)用SpectraMax®iD3多功能微孔板讀板機(jī)檢測內(nèi)源色氨酸熒光。色氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線用來顯示檢測方法的高靈敏性，而色氨酸發(fā)射峰值的偏移則用溶菌酶變性實(shí)驗(yàn)來檢測。溶菌酶包含有兩個(gè)色氨酸殘基，因此受到紫外光照射時(shí)會(huì)發(fā)射熒光。當(dāng)溶菌酶降解時(shí)，色氨酸的發(fā)射光峰值會(huì)偏移6-10nm。我們可以對(duì)降解前后的溶菌酶進(jìn)行熒光光譜掃描來捕獲和檢測發(fā)生的峰值偏移。SpectraMax® iD3多功能微孔板讀板機(jī)兼具內(nèi)源色氨酸熒光檢測所需的高靈敏度和波
長掃描能力。另外，SoftMax® Pro 軟件可以通過Spectral Optimization Wizard自動(dòng)識(shí)別最最佳的激發(fā)和發(fā)射波長，同時(shí)自動(dòng)計(jì)算發(fā)射峰值的偏移，并用于后續(xù)分析。

方法
我們預(yù)先準(zhǔn)備了起始濃度為100 μM的色氨酸樣本并進(jìn)行了倍比稀釋。將原濃度和稀釋后的樣本按照每個(gè)樣本三復(fù)孔（每孔200微升）的方式加入至UV高透的96孔板中。在六個(gè)空白孔中加入PBS作為對(duì)照來
計(jì)算檢測的最低限值 (LLD)。SoftMax Pro軟件的Spectral Optimization Wizard用來優(yōu)化獲得最佳激發(fā)和發(fā)射光波長。通過波長優(yōu)化后的結(jié)果，我們可以準(zhǔn)確檢測到色氨酸的倍比稀釋關(guān)系。我們用終濃度為5 M 的鹽酸胍處理10mg/mL的溶菌酶溶液使之變性，然后我們用SpectraMax iD3 讀板機(jī)對(duì)變性前后的溶菌酶樣本進(jìn)行光譜掃描，其激發(fā)光為270nm而發(fā)射光在300nm到450nm之間。運(yùn)用SoftMax Pro Software中預(yù)先設(shè)定的程序可以自動(dòng)識(shí)別發(fā)射光峰值。

材料
• SpectraMax iD3 多功能微孔板讀板機(jī)
(Molecular Devices cat. #ID3-STD)
• L-色氨酸 (Sigma cat. #T-0254)
• 溶菌酶 (Sigma cat. #L6876)
• 鹽酸胍 (Sigma cat. #G7294)
• UV高透的 96孔板
(Greiner cat. #655801)
• 磷酸鹽緩沖液 (PBS), pH 7.4）

結(jié)果
利用SoftMax Pro軟件的Spectral OptimizationWizard可以將激發(fā)光和發(fā)射光波長做優(yōu)化(圖1)。這一特征可以使這些波長的測量有最優(yōu)的信噪比(激發(fā)光波長285nm，發(fā)射光波長345nm)。通過波長的最優(yōu)化方式，SpectraMax iD3讀板機(jī)可以準(zhǔn)確的測量色氨酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其檢測最低限值可以達(dá)到9.5nM并且
有很好的線性(r2>0.99) (圖2)。光譜掃描結(jié)果顯示在溶菌酶降解后其發(fā)射光波長峰值從350nm遷移到355.5nm并伴隨熒光強(qiáng)度的略微增強(qiáng)(圖3)。這一發(fā)射光波長峰值的遷移程度也十分接近預(yù)期值。

結(jié)論
SpectraMax iD3 讀板機(jī)可以通過測量色氨酸內(nèi)源熒光對(duì)蛋白定性。利用15nm激發(fā)光和25nm發(fā)射光的帶寬，讀板機(jī)可以在低波長光譜范圍內(nèi)檢測低濃度的色氨酸。另外，Spectral Optimization Wizard可以自動(dòng)識(shí)別最優(yōu)化的激發(fā)光和發(fā)射光波長。利用SoftMax Pro 軟件預(yù)先設(shè)定的程序，研究人員可以自動(dòng)檢測溶菌酶降解前后的波長峰值及其遷移，從而節(jié)省了大量用于數(shù)據(jù)分析的時(shí)間。