理論上使用公認選擇的親和純化抗體可得到高特異性，高敏感度的免疫測定。然而，由于經濟原因或是缺乏合適的試劑，使得許多工作者采用低純度的制品，這種試劑通常含有與試驗中其它成分起交叉反應的抗體。現已發現在用抗人IgG抗血清的抗體時，抗體中含有不需要的抗體交叉反應。但當使用親和純的抗血清時，交叉反應不明顯。研究任何ELISA系統，為了控制不需要的交叉反應，就要不惜使用親和純試劑。使用抗IgG血清抗體作為包被抗體，有時本底確實很低，但它的敏感度比僅使用親和純制品要低50-100倍。在高敏感度的實驗中應用封閉試劑是很重要的。最終選擇非親和純抗IgG血清抗體是基于這樣設想：包被抗體或是結合的人IgG（抗原）與指示抗體有交叉反應，則過量的與指示抗體同種動物的血清，就可以封閉與酶標抗體的不要的結合。然而人血清白蛋白中含有少量的IgA和IgG會干擾檢測。人血清白蛋白只適用于IgE的測定。同樣，不能用牛血清白蛋白。因為其中含有微量的牛IgG。

抗血清抗體與親和純抗體對ELISA夾心法結果的影響可從下面實驗看出。

實驗a：包被抗體為粗制的綿羊抗人IgG抗體，指示抗體（檢抗）為粗制山羊抗人IgG抗體

實驗b：包被抗體為親和純的綿羊抗人IgG抗體，指示抗體（檢抗）為粗制山羊抗人IgG抗體

實驗c：包被抗體為粗制的綿羊抗人IgG抗體，指示抗體為親和純的山羊抗人IgG抗體

實驗d：包被抗體和指示抗體都是親和純的兔抗人IgG抗體。

實驗中使用5%血清（與指示抗體同物種來源）進行封閉，其他夾心法ELISA步驟相同。

結果顯示，當粗制的抗IgG血清抗體被用在夾心法的兩端（如實驗a曲線）時，本底很高且曲線坡度不明顯。雖然能成功應用此抗體類型，但問題是一種抗體結合另一種抗體�？赡馨l生了山羊指示抗體結合了綿羊包被抗體，因為稀釋液中的山羊血清過剩也不能降低本底值。當應用親和純化的包被抗體時（如實驗b曲線），本底適當降低而且形成了標準曲線。然而，大多數工作者認為本底仍偏高，工作范圍有限（2-60ng/ml）。當親和純的指示抗體與粗制包被抗體聯合使用時（如實驗c曲線），本底大大較低，但敏感度約為100-200ng/ml，再者工作范圍仍受限。當完全使用親和純的抗體時（如實驗d曲線），本底低，敏感度大大改善且工作范圍廣（2-500ng/ml）。

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