簡介

單純皰疹病毒2型（HSV-2）是潰瘍性生殖器皰疹的主要病原，全球每年新增感染達2300萬例，其治療方式主要圍繞口服抗病毒治療展開，但已有HSV-2候選疫苗進入臨床試驗，包括滅活、活性衰減、亞單位、DNA及多肽疫苗等，其中，野生型病毒刪除UL5和UL29基因構建的復制缺陷型HSV-2疫苗株病毒（dl5-29再衍生，并重命名為ACAM529）被認為是較有效的候選疫苗，在小鼠和豚鼠體內都有效誘導了保護性免疫反應。但傳統使用疫苗經離心純化方法制備，該技術不適用于商業化生產。

臨床用病毒疫苗的制備包括上游病毒生產和下游病毒純化，后者需維持病毒感染性，并清除宿主細胞雜質。已有多種方法用于純化細胞培養衍生病毒顆粒，本實驗使用膜層析結合中空纖維切向流過濾（TFF）制備高純度、功能性ACAM529疫苗，主要步驟包括使用硫酸葡萄糖（DS）從感染的互補Vero細胞培養中洗提ACAM529、核酸內切酶處理、深層過濾、陰離子交換層析、中空纖維切向流過濾，處理獲得的疫苗株病毒純度較高，且具有良好的免疫源性。

實驗

實驗使用Vero細胞系AV529-19，按已有方法制備ACAM529主病毒種子庫。小規模培養生產使用12孔板和T125搖瓶，然后放大至10層NUNC細胞工廠（NCF，工作體積2L，培養面積6320cm2，Thermo Fisher），對培養條件進行優化，以確保ACAM529產率最大化。

實驗使用兩種方法純化ACAM529，第一種方法使用平面膜包式切向流過濾結合蔗糖墊層超速離心，具體操作包括從NCF手動刮離感染細胞，離心后加入穩定緩沖液重懸，細胞懸液加入微流機（Microfluidics Corporation）機械破碎細胞并切斷細胞基因組DNA，然后加入Benzonase^®核酸內切酶(Merck Millipore)處理后，離心澄清。澄清后的細胞裂解液使用配有3個30kD、50cm²聚醚砜板式膜的過濾系統從1100mL濃縮至50mL，過濾過程中，入口壓力維持為30psi，背壓從1psi上升至8psi，以達到足夠的流速。過濾后的回流液使用25%蔗糖墊層超速離心處理4h（50,000×g，4℃），并將獲得的ACAM529顆粒重懸于20%蔗糖穩定緩沖液，-80℃儲存。

第二種方法使用膜層析結合中空纖維切向流過濾。具體操作時，先倒出NCF中的感染培養基，加入DS洗提緩沖液，孵育后離心澄清，加入Benzonase^®反應液，溫和攪拌，反應特定時間后，使用0.65μm深層過濾器過濾清除殘留的細胞碎片及其它聚集雜質。膜層析使用Mustang^®Q濾芯（Pall Corporation），操作前先滅菌、預濕、低鹽平衡，上樣后用平衡緩沖液漂洗，然后用0.7M NaCl緩沖液洗脫雜質，再用2MNaCl緩沖液洗脫含ACAM529餾分，后者使用KrosFlo^® 研發用IIi 切向流過濾系統（產品編號：SYR2-U20-01N；配100kD、85cm²聚砜中空纖維過濾組件）濃縮5-10倍，并進行3-5體積洗濾后換液至20%蔗糖穩定緩沖液。操作過程中，為降低剪切，流速設定為130mL/min（剪切約為4,000S^-1）。洗濾時，跨膜壓（TMP）控制為4psi以下，以減緩凝膠層形成。產物于-80℃保存。所有操作在無菌條件下進行，因HSV-2病毒顆粒較大（180-200nm），無法對終產物進行除菌過濾。

產物純化后，測定ACAM529滴度，并使用ELISA、qPCR及PicoGreen dsDNA分析法檢測ACAM529純度，免疫源性通過小鼠皮下免疫實驗進行分析。

結果

使用蔗糖墊層超速離心進行ACAM529實驗室規模制備時，每1 X 107 PFU ACAM529中會有2μg以上的宿主細胞DNA殘留，而使用本實驗方法二時，殘留量低于10ng，如以宿主細胞蛋白殘留為衡量標準，該方法產物純度高出200倍，而工藝處理液雜質為衡量標準時，純度高出2個數量級。

使用機械細胞破碎時，產物中會有較高的dsDNA殘留。替代方法是使用DS，從宿主細胞表面有效化學洗提獲得ACAM529，并使用Benzonase^®核酸內切酶降低產物中的DNA載量。

在比較了一系列層析方法后發現，使用Mustang^® Q膜層析濾芯所獲得的階段收率最高，而使用KrosFlo^®中空纖維切向流過濾系統替換板式膜過濾系統，可有效使收率加倍，原因可能是開放式流道降低了剪切，而在板式膜設計中增加了用于形成湍流的篩網，雖然篩網在一定程度上可提高流速，降低凝膠層形成，但同時亦增加對樣品的剪切力。

如以產物中Vero宿主細胞蛋白（HCP）為衡量標準，ACAM529終產物純化因子可達250倍，而Vero DNA含量亦低于WHO規定限量。純化過程中加入的DS、Benzonase^®等可分別在深層過濾及膜層析過程中清除。此外，動物免疫實驗表明，層析純化獲得的ACAM529具有與蔗糖墊層離心純化獲得的樣品一致的免疫源性和保護性。

討論

ACAM529是一種復制缺陷的預防性候選疫苗，在初步的動物實驗中已證明其效力，但為滿足進一步的動物及臨床實驗需要，急需一種可規模放大的下游純化工藝。本實驗使用方法結合DS洗提、Benzonase^®處理、深層過濾、膜層析及中空纖維超濾/洗濾，有效提高了疫苗總收率。

實驗中發現，流體動力學剪切壓力對于感染性病毒滴度的損耗非常關鍵，所以將封閉流道板式膜TFF及微珠層析更換成開放流道的中空纖維TFF及膜層析，從而在純化步驟的每個階段都可獲得更高的感染性病毒收率。動物實驗中獲得的疫苗免疫源性及保護性效力數據，也確認了工藝的可行性。

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原文：Mundle, S.T., Hernandez, H., Hamberger, J., etal., High-Purity Preparation of HSV-2 Vaccine Candidate ACAM529 Is Immunogenicand Efficacious In Vivo. PLOS ONE,2013, 8(2):1-10.