前言

在研究中經常會涉及DNA或染色體的損傷，因為DNA損傷與很多疾病的發生有密切的關系，如遺傳疾病、腫瘤等。放射性輻射、環境影響或化合藥物等都有可能引起DNA的損傷。之前的研究表明標記組蛋白H2AX在絲氨酸139上的磷酸化位點是敏感的可早期預測DNA雙鏈斷裂的方法。本文詳細介紹了自動細胞成像檢測DNA損傷的實驗方法，細胞樣品由小分子化合物處理，經過磷酸化組蛋白H2AX免疫熒光染色后成像。另外，實驗中選用了三種細胞系，CHO、Hela和PC-12，分別加入絲裂霉素和依托泊苷進行處理來檢測化合物對其的影響。

磷酸化H2AX免疫熒光方法定量DNA損傷

細胞水平的DNA損傷可應用商業化的試劑和ImageXpress^® Nano自動成像與分析系統可視且定量。免疫熒光法用的是抗磷酸化H2AX(EMD Millipore)的一抗和AlexaFluor標記的二抗(Life Technologies)。Hoechst33342染核，由ImageXpress Nano獲取圖像，10X物鏡，DAPI和FITC通道。

- 在平底透明384孔板中種入細胞，5,000-7,500細胞/孔
- 在37°C/5%CO2環境下放置細胞過夜
- 按1:2系列梯度DNA毒性化合物加入孔中，處理細胞18-24小時
- 室溫下用4%多聚甲醛固定細胞
- PBS洗去固定液，然后加入1%BSA+0.1%TritonX-100對細胞進行封閉并打孔，室溫孵育30分鐘
- 加入抗H2AX一抗4℃孵育過夜
- 1XPBS洗3次
- 加入熒光二抗和16μMHoechst室溫孵育1-2小時
- 1XPBS洗3次
- 用ImageXpressNano系統10X物鏡下獲取圖像，并運行CellScoring模塊實時定量

優勢

- 細胞固定后用免疫法對細胞核進行熒光染色，并成像
- 精確計算DNA雙鏈斷裂位點
- On-the-fly分析可實時得出計算結果
- 通過熱圖顯示陽性孔

Cell Scoring模塊實時高效定量DNA損傷DNA損傷

CellReporterXpress^TM自動圖像獲取與分析軟件包括了預置的Cell Scoring模塊，它可以輕松根據DNA損傷標記設定損傷陽性和陰性分類，并計算出產生DNA損傷的細胞百分比。圖像獲取和分析通常是一起運行的，孔板讀取完就可以同時看到圖像和分析得到的數據。另外，由于檢測器的大靶面特性，10X物鏡下一個視野的細胞足夠定量得到具有統計學意義的濃度效應曲線數據了(圖2)。其次，在此拍攝條件下，一個視野可拍攝>500個細胞(絲裂霉素C最高濃度)和>2800個細胞(低毒性濃度的絲裂霉素C)。

參考文獻

1. Paull T.T., Rogakou E.P., Yamazaki V.,Kirchgessner C.U., Gellert M., BonnerW.M..2000. A critical role for histone H2AXin recruitment of repair factors to nuclearfoci after DNA damage. Curr Biol. 10,