抗體是自然產生用于幫助免疫系統抵御細胞內外侵害的免疫球蛋白。免疫熒光法測定細胞水平的抗體親和力大小是評價抗體效果非常重要的指標，當前主要的測定方法是利用流式細胞儀以實現相對定量。而Countstar^® FL可通過間接免疫熒光法檢測不同抗原抗體反應呈現的平均熒光強度直接定量評價抗體親和力大小，同時也可檢測細胞濃度、活率。此外，可獲得細胞圖片，實驗過程中實時拍攝明場和熒光圖像。Countstar^® FL為客戶在抗體藥物篩選中提供了快速、準確、可靠的抗體親和力檢測方法。Countstar^® FL（圖1）是一個智能的、直觀的細胞分析儀器用于多種細胞實驗，包括細胞轉染，細胞凋亡，細胞表面標志物，細胞活力，抗體親和力和細胞周期的評估。該系統提供了強大的熒光定量結果。易于使用的自動化程序指導你完成從細胞圖像采集到數據分析的過程。

材料：

Countstar 產品:Countstar® FL細胞分析儀/Countstar®樣品板/0.2% 臺盼藍染色液 (CS0101001-50)

其他材料

CHO細胞系/DMEM細胞培養基(Hyclone-SH30243.01)/胎牛血清(Hyclone-SH30084.03)/胰蛋白酶(Hyclone-SH30042.01)，其中，CHO細胞系穩定表達X蛋白，用于評價原研藥和仿制藥的親和力

一抗：不同濃度梯度的002-BMK1,002-BMK2, AB1, AB2, AB3, AB4, AB5, AB6, AB7, AB8, AB9, PCSK-9。其中，002-BMK1,002-BMK2能特異性的與X蛋白結合（陽性抗體），PCSK-9是陰性對照抗體。

二抗：Alexa Fluor® 488 Goat anti-mouse IgG (Biolegend)，5µg/mL

軟件

GraphPad Prism5®

方法：

細胞培養條件

1. CHO細胞培養在完全培養基中，組成為：500mLDMEM培養基，2 mM L-谷氨酰胺, 1.5 g/L 碳酸氫鈉和10% 胎牛血清。于37°C, 5% CO2培養箱中培養48小時；

2. 消化收集細胞。

染色步驟

1. 使用臺盼藍計數測定細胞濃度；

2. 準備3*10^5個細胞/每個反應；

3. 細胞樣品于400g下離心3-5分鐘，去上清，用100µL PBS重懸；

4. 輕輕混勻細胞樣品，于400g下離心3-5分鐘，去上清，用100µL Cellstaining buffer重懸；

5. 在細胞樣品中加入不同濃度梯度的一抗，每種抗體最高濃度為10µg/mL，4倍梯度稀釋，最低濃度為0.01µg/mL；

6.  37℃下，避光孵育60分鐘；

7.  細胞樣品于400g下離心3-5分鐘，去上清，用100µL PBS重懸；

8.  輕輕混勻細胞樣品，于400g下離心3-5分鐘，去上清，用100µL Cellstaining buffer重懸；

9.  在每個反應組內加入5µg/mL二抗；

10. 常溫下，避光孵育30分鐘；

11. 細胞樣品于400g下離心3-5分鐘，去上清，用100µL PBS重懸；

12. 輕輕混勻細胞樣品，于400g下離心3-5分鐘，去上清，用100µL Cellstaining buffer重懸；

13. 混勻樣品，加入20µL于細胞計數板中，上機檢測。

注：以上操作可使用EP管或96孔板。

圖像獲取及數據分析

1.選用“臺盼藍計數”進行細胞濃度和活率測定；

2.單熒光模塊的程序用于獲取FITC通道下Alexa Fluor® 488的圖像；

3.每個樣品采集1或3個視野（該實驗檢測1個視野）；

4.檢測過程中直接呈現數據結果，圖像獲取和數據分析完成后，導出數據結果。抗體親和力檢測過程如圖2。

圖2.抗體親和力檢測過程 

不同抗體梯度稀釋添加劑量

選用96孔板測定不同抗體與CHO細胞反應的劑量效應實驗，包括原研藥、抗體藥和陰性對照（圖3）。一抗濃度按照下表指示梯度降低(10µg/mL-0.01µg/mL)。 

圖3. 96孔板中抗體濃度. 每孔中有CHO細胞（30萬個），二抗(5µg/mL)及圖示一抗(0.01, 0.039, 0.156, 0.625, 2.5, 10µg/mL).其他孔為空.

Countstar® FL系統圖像獲取

Countstar® FL內置的抗體親和力檢測程序進行明場，FITC通道下Alexa Fluor® 488圖像的獲取。明場的圖像作為一個參考標準對熒光場的圖像進行分割，進而獲取熒光場的信號。不同濃度梯度AB4，最高濃度PCK9和002-BMK1樣本圖像結果如圖3所示。

圖4. 0.01, 0.039, 0.156, 0.625, 2.5, 10µg/ml AB4與CHO細胞反應后的細胞圖像.

圖像顯示抗體濃度越高，熒光信號越強. 002-BMK1抗體能特異性的與X蛋白結合，PCSK-9為陰性對照抗體. 圖像代表002-BMK1樣品有較強的熒光信號，PCSK-9樣品基本沒有熒光信號.

抗體親和力定量分析

不同抗原抗體反應呈現的平均熒光強度直接定量評價抗體親和力大小。穩定表達X蛋白的CHO細胞系應用于分析抗體親和力，Countstar®FL可直接顯示測試結果，并將數據導出進行分析。使用GraphPad Prism5®對抗體的EC50進行分析(Fig. 5A)。測試結果顯示樣品熒光強度隨著一抗濃度升高而增加，平均熒光強度曲線代表不同濃度下每個抗體的反應活性，其中PCSK-9為陰性對照抗體，樣品基本沒有熒光信號。各抗體的LogEC50結果顯示原研藥的抗體親和力比仿制藥更好，而仿制藥中AB2, AB3, AB4, AB6效果較好，可進行下一步實驗(Fig. 5B)。Countstar® FL系統為評價抗體親和力提供直接可靠的結果。                                                   

圖5. 抗體親和力定量分析結果. A.不同濃度梯度抗體下不同抗原抗體反應中平均熒光強度.B.原研藥和仿制藥的分析結果比較.

總結：

Countstar^® FL系統提供了一個快速，直接，容易的方法評價抗體親和力。此外，它是融合了電子顯微鏡，圖像處理，自動細胞計數于一體的設備。另外，Countstar^®  FL提供擴展功能，用戶可以根據自身需要進行定制。Countstar^® FL是一款高度可移動的設備，內置多種預設程序，便于用戶快速獲取準確，穩定，可高度重現的數據。儀器中每個應用模塊簡單易用，大大簡化了常規實驗室的工作，給客戶提供高質量的科研數據。Countstar^® FL為客戶開展抗體親和力實驗提供一個直接可靠的實驗結果。