dek35編碼PPR蛋白影響玉米籽粒的線粒體nad4基因內含子1的順式剪接和發育
農林RNA測序助力玉米籽粒dek35突變體研究
該研究與前幾天RNA測序在玉米籽粒dek2突變體中分子機制的研究應用相似，研究的主角依然是上海大學生命科學學院，該工作主要由陳鑫澤博士完成。研究對象由dek2突變體變為了dek35突變體。
研究思路
研究結果
dek35突變表現出發育遲緩的表型
本研究中dek35突變來源于美國玉米種質中心，編號為5605F。其表現出小籽粒，并且頂部種皮中空（圖1）。突變體百粒重只有野生型20%（dek2是35%）（圖1）�？偟矸邸⒅辨湹矸酆涂們Σ氐鞍缀繘]有顯著變化，醇溶蛋白在突變體中顯著下降。亞細胞層面觀察發現，胚乳轉移層細胞（BETL）在突變體中發育遲緩，表明籽粒發育受到抑制（圖1）。
dek35基因克隆
研究人員對dek35突變體進行圖位克隆，將其定位于玉米1號染色體254,244,136 bp to 289,337,516 bp大約35M區段內。由于該突變來源于Mutator突變系，研究人員懷疑其可能含有Mu的插入（圖2）。對其進行Mu標簽分離表明，一個Mu標簽存在于35M的區段內，插入在了GRMZM2G066749起始密碼子下游30bp處。該結果同樣通過等位測試驗證（圖2）。
dek35編碼了一個P-type PPR蛋白
研究人員通過將GRMZM2G066749蛋白編碼序列在數據庫中比對后發現，該基因編碼了一個P-type PPR蛋白（圖2）。
dek35在籽粒發育過程中持續性表達
研究人員通過定量PCR以及Western Blot雜交發現，dek35是一個全組織表達的基因（圖3）。
dek35定位于線粒體中
將dek35連接入熒光表達載體，使其與黃色熒光蛋白YFP融合，并對其共聚焦顯微鏡亞細胞定位研究。結果發現，dek35定位于線粒體內嵴（圖4）。
dek35影響nad4內含子1的剪切
由于PPR蛋白可以與對應的線粒體或者葉綠體RNA互作，因此研究人員對dek35突變體胚乳以及野生型胚乳的線粒體轉錄本進行了分析。研究人員使用特異的引物擴增了線粒體cDNA，在35個基因中，只有nad4的成熟轉錄本在dek35中顯著下降（圖5）。進一步研究發現，nad4內含子1在dek35中顯著下降導致了全長成熟轉錄本表達量下降。
dek35影響了線粒體復合物I的聚集
為了深入研究線粒體的呼吸復合物，研究人員分離了dek35 線粒體蛋白并且進行了非變性的BN-PAGE電泳。電泳結果顯示，復合物I含量顯著下降（圖6）。該結果證明了nad4內含子1的剪切影響導致了復合物I功能的下降（圖7）。
dek35影響了線粒體的正常功能
研究人員為了對dek35在籽粒發育過程中的作用有全局性的了解，分別選取了的dek35胚乳以及野生型胚乳進行了RNA轉錄組測序（RNA-Seq服務由伯豪生物提供）。經過數據分析，一共篩選到了4720個差異基因，其中632個基因具有功能注釋。在GO歸類后，研究人員發現，這些基因主要聚集于mitochondrial inner membrane (GO:0005743, P-value=2.2E-07), ATP synthesis coupled proton transport (GO:0015986, P-value=0.00043), protein targeting to mitochondrion (GO:0006626, P-value=2.0E-05) and cytochrome-c oxidase activity (GO:0004129, P-value=0.0024) （圖8）。
dek35突變體線粒體形態變化顯著
為了對dek35突變體線粒體有深入的表型觀察，研究人員最后還通過透射電鏡觀察了突變體與野生型的表型變化。結果發現，突變體的線粒體呈現畸形的表型（圖9）。
研究結論
dek35與dek2同樣編碼了一個定位于線粒體的P-type PPR蛋白。dek35突變導致了顯著的該基因蛋白水平的下降，降低了對nad4內含子1剪切效率（dek2是降低nad1內含子1的剪切效率）。對dek35突變體線粒體復合物的分析發現，dek35未成熟籽粒表現出了復合物I顯著的缺失以及NADH脫氫酶活性顯著下降。對dek35突變體籽粒進行轉錄組測序發現，呼吸相關基因表達量顯著升高，線粒體功能相關基因表達量變化顯著。該結果表明dek35突變體是一個新的PPR蛋白影響了線粒體nad4內含子1的順勢剪切。并且對籽粒發育至關重要。
原文出處：Chen X, Feng F, Qi W, Xu L, Yao D, Wang Q, Song R. Dek35 Encodes a PPR Protein that Affects cis-Splicing of Mitochondrial nad4 Intron 1 and SeedDevelopment in Maize. Mol Plant. 2016.
