上期分享的蛋白組學內容，是不是有些小伙伴還繞在云里霧里呀？這次，小編用實例說話，幫您梳理清楚。

一、Label-free定量

  Label-free定量，顧名思義就是不需要對比較樣本做特定標記處理，只需要比較特定肽段/蛋白在不同樣品間的色譜質譜響應信號便可得到樣品間蛋白表達量的變化，通常用于分析大規模蛋白鑒定和定量時所產生的質譜數據。

  Label-free技術又可分為基于譜圖數（Spectra Count，簡稱SC）和基于肽段母離子強度（或色譜離子流的峰面積即XIC）兩種方法，后者更準確，使用更廣泛。

技術特點

無需標記，操作簡單；

不受比較樣品數限制；

對實驗操作穩定性、重復性要求高；

準確性較標記定量差；

要求至少做三次技術重復或生物重復。

適用范圍

適合大樣本量的定量比較；

對無法用標記定量實現的實驗設計，易用label-free技術；

經典案例

題目：Label-free global serum proteomic profiling reveals novel celecoxib-modulated proteins in familial adenomatous polyposis patients（利用Label-free定量技術進行家族性腺瘤息肉病患者血清的全蛋白質組分析，尋找Celecoxib調控蛋白）

期刊：Cancer genomics proteomics

主要技術：Label-free定量

文章摘要：Celecoxib是一種環氧合酶選擇性抑制劑，能夠對患有預防家族性腺瘤性息肉病（FAP)和散發性大腸癌的病人進行防治。為了識別其具體的作用機制，本文采用多維色譜分離方法結合電噴霧串聯質譜，使用Label-free定量技術，比較經Celecoxib處理前、后血清樣品的蛋白質組表達量差異。發現了83個可能為Celecoxib響應的表達量顯著差異蛋白。通過Western blotting方法，在FAP病人和結腸直腸癌細胞系中進一步確認了一些Celecoxib調控蛋白，為進一步進行Celecoxib作用機制的大規模臨床試驗奠定了基礎。

圖：Apo A-II蛋白中特征肽的定量結果比較

注：AB為處理前，CD為處理后

Fatima N, Chelius D et al. Label-free global serum proteomic profiling reveals novel celecoxib-modulated proteins in familial adenomatous polyposis patients. Cancer genomics proteomics.

文獻來源：Fatima N, Chelius D, Luke BT, Yi M, Zhang T, Stauffer S, Stephens R,Lynch P, Miller K, Guszczynski T et al: Label-free global serum proteomic profiling reveals novel celecoxib-modulated proteins in familial adenomatous polyposis patients. Cancer genomics proteomics 2009, 6(1):41-49.

二、iTRAQ定量

iTRAQ(isobaric tags for relative and absolute quantitation，同重同位素標簽標記的相對和絕對定量)技術也是目前定量蛋白質組學中應用最廣泛的技術。

  iTRAQ試劑分為報告基團、平衡基團和肽反應基團。報告基團共有8種（113、114、115、116、117、118、119、121 Da)。肽反應基團能與肽鏈N端及賴氨酸側鏈發生共價鏈接，從而將報告基團和平衡基團標記在肽段上；平衡部分質量分別為192~184，與報告部分相加正好為305。

  在一級質譜圖中，任何一種iTRAQ試劑標記不同樣本中的同一蛋白質表現為相同的質荷比。在二級質譜中，iTRAQ試劑中的平衡基團發生中性丟失，信號離子表現為不同質荷比(113~121) 的峰，根據波峰的高度及面積，可以得到同一蛋白在不同樣本中的表達差異；同時，肽段的MS/MS結果結合數據庫檢索可以鑒定出相應的蛋白種類。

技術特點

靈敏度高：可檢測出較低豐度蛋白，胞漿蛋白、膜蛋白、核蛋白、胞外蛋白等；

分離能力強：可分離出酸/堿性蛋白，小于10K或大于200K的蛋白、難溶性蛋白；

高通量：可同時對8個樣本進行分析，特別適用于采用多種處理方式或來自多個處理時間的樣本的差異蛋白分析；

結果可靠準確：定性與定量同步進行，同時得出鑒定和定量結果。

自動化程度高：液質連用，自動化操作，分析速度快，分離效果好。

適用范圍

適用于任何類型的樣本；

一次最多能標記8個樣本；

經典案例

題目：A tumour suppressor network relying on the polyamine-hypusine axis（一種基于多胺Hypusine軸（Polyamine-hypusine axis）的新型腫瘤抑制網絡）

期刊：Nature

主要技術：iTRAQ定量

文章摘要：為尋找淋巴瘤的抑癌基因，首先通過篩選短發夾RNA文庫的方法，識別出一些抑制后會引起小鼠淋巴瘤模型腫瘤擴增的基因。然后采用iTRAQ定量技術對兩個有意義的淋巴瘤抑癌基因——AMD1和Eif5A的表達調控進行研究，發現這兩個基因都與Hypusine(Hypusine是一種獨特的氨基酸，由一種高保守途徑產生的多胺代謝產物)相關。通過進一步的二次篩選，確定了多胺Hypusine軸的新型抑癌基因網絡，這一網絡能調控細胞凋亡。

     

圖：iTRAQ定量流程和蛋白質比值分布圖

Scuoppo C, Miething C et al. A tumour suppressor network relying on the polyamine-hypusine axis. Nature.

文獻來源：Scuoppo C, Miething C, Lindqvist L, Reyes J, Ruse C, Appelmann I,Yoon S, Krasnitz A, Teruya-Feldstein J, Pappin D et al: A tumour suppressor network relying on the polyamine-hypusine axis. Nature2012, 487(7406):244-248.

三、SILAC定量

  SILAC（Stable Isotope Labeling Strategies,穩定同位素標記技術）為全面、系統地定性和定量分析復雜哺乳動物細胞蛋白質組提供了有效的方案。

  SILAC的基本原理是分別用天然同位素(輕型)或穩定同位素(中性或重型)標記的必需氨基酸取代細胞培養基中相應氨基酸，細胞經5-6個倍增周期后，穩定同位素標記的氨基酸完全摻入到細胞新合成的蛋白質中替代了原有氨基酸。不同標記細胞的裂解蛋白按細胞數或蛋白量等比例混合，經分離、純化后進行質譜鑒定，根據一級質譜圖中兩個同位素型肽段的面積比較進行相對定量，屬于體內代謝標記法。

技術特點

高效性：SILAC是體內標記技術，標記效率可高達100%；

定量精確，線性范圍廣，降低由于樣品制備、實驗操作和儀器設備造成的實驗誤差，定量重復性好；

體內代謝標記與SDS-PAGE或色譜分離技術相結合，兼容疏水性蛋白和偏堿性蛋白，不受蛋白性質限制；

由于該技術屬于體內標記，標記效果穩定，其標記效率不受裂解液的影響，不僅適合于進行全細胞蛋白的分析，還適合于膜蛋白的鑒定和定量；

與化學標記相比，SILAC方法蛋白需要量明顯減少，通常每個樣品只需要幾十微克的蛋白量；

活體標記，更接近樣品真實狀態；

相容性：可以對多種在DMEM或RPMI 1640培養基中能夠培養的細胞或細菌中表達的蛋白進行標記。

適用范圍

只適用于活體培養的細胞，對于生物醫學研究中常用的組織樣品、體液樣品等無法分析。

經典案例

題目：Proteome-wide Mapping of Cholesterol-Interacting Proteins in Mammalian Cells（采用甾醇探針結合SILAC定量技術在哺乳動物細胞中分析膽固醇-蛋白質相互作用）

期刊：Nat Methods

主要技術：SILAC定量

文章摘要：膽固醇是細胞膜的重要結構成分，也是前體的信號分子，在很大程度上通過與蛋白質的特異性相互作用調控參與發揮其作用。本文采用可點擊的光敏甾醇探針結合SILAC蛋白質組定量技術直接在活體細胞中全面解析了膽固醇-蛋白相互作用。最終確定了超過250個膽固醇結合蛋白，包括受體、通道蛋白和涉及許多已建立和之前未報告相互作用的酶。新發現的蛋白質相互作用中最突出的是調節糖、甘油脂和膽固醇本身以及參與囊泡運輸和蛋白質糖基化和降解蛋白質的酶。這些蛋白指向關鍵節點的生化途徑，說明甾醇濃度和其他代謝物的控制可能和蛋白定位以及修飾高度相關。

   

           圖：實驗基本流程           圖：膽固醇生物合成通路

                 

注：黑色字符蛋白表示沒有鑒定         

Jonathan J et al. Proteome-wide Mapping of Cholesterol-Interacting Proteins in Mammalian Cells. Nature methods.                                                                             

文獻來源：Jonathan J, Armand B, Micah J, Sarah E, Benjamin F: Proteome-wide Mapping of Cholesterol-Interacting Proteins in Mammalian Cells.Nature methods, 2013 March; 10(3):259-264.

四、SWATH定量

  SWATH（Sequential Window Acquisition of all Theoretical Mass Spectra）是瑞士蘇黎世聯邦理工學院的Ruedi Aebersold 博士及其團隊與AB-SCIEX于2012年聯合推出的一項全新的質譜采集模式技術，是 MS/MSALL技術的一種擴展。它將掃描范圍劃分為以25 Dalton為間隔的一系列區間，通過超高速掃描來獲得掃描范圍內全部離子的所有碎片信息。

技術特點

靈敏度高：SWATH技術繼承了MRM的數據采集模式，結合高分辨率的AB sciex Triple TOF-plus，具有與MRM相當的靈敏度；

可重現性高：重復樣品間的定量相關性可達0.99以上；

線性動態范圍廣：定量范圍可跨越4個數量級；

通量大：一次實驗可檢測到2000種以上蛋白并定量。

適用范圍

最好檢測細菌等復雜度較低的樣品；

可以和MRM技術聯合使用發現生物標志物；

可以和TAP技術聯合使用鑒定相互作用蛋白。

經典案例

題目：SWATH-and iTRAQ-based quantitative proteomic analyses reveal an overexpression and biological relevance of CD109 in advanced NSCLC (利用SWATH和iTRAQ定量技術揭示CD109在晚期非小細胞肺癌的過表達和生物相關性)

期刊：Journal of proteomics

主要技術：SWATH、iTRAQ

文章摘要：文章采用iTRAQ和SWATH定量技術，對癌細胞高轉移和低轉移非小細胞肺癌細胞系中蛋白的表達量變化（分別與正常狀態比較）進行了分析。分別在細胞系分泌蛋白組和非小細胞肺癌血清中找到110個和71個存在顯著差異的蛋白。研究者發現，在這些差異蛋白中，CD109在高度轉移的細胞系分泌蛋白組和癌癥晚期患者組都有較高的表達量，ELISA檢測也得到相同的結論。另外，和正常肺細胞比較，CD109在肺癌細胞中也高度表達。研究者還發現，敲出CD109蛋白會影響NSCLC細胞的生物功能，如抑制細胞生長、影響細胞循壞階段等。這些現象表明，CD109在NSCLC的進程中扮演著重要角色，很有可能是肺癌發病一個關鍵的生物標志物。

 

圖：SWATH定量蛋白表達量比值分布

iTRAQ定量和SWATH定量蛋白比值相關性分布