溫陽解郁湯對抑郁模型大鼠HPA軸的影響

摘要：目的：研究溫陽解郁湯對慢性應激抑郁大鼠HPA軸的影響，初步探討其抗抑郁作用的機制。方法：雄性Wistar大鼠，隨機分為6組，正常對照組和模型對照組灌胃0.9%氯化鈉溶液，溫陽解郁湯高、中、低劑量組灌胃溫陽解郁湯濃縮煎劑（8、6、4g/kg）、陽性藥對照組灌胃鹽酸氟西汀（3.33mg/kg），除正常對照組外其余各組在灌胃同時接受慢性不可預知溫和刺激（CUMS）刺激并孤養28d。采用強迫游泳實驗（FST）、懸尾實驗（TST）、曠場實驗（OFT）對各組大鼠進行行為學評價；q PCR檢測大鼠下丘腦CRH m RNA和海馬GR m RNA的表達；放射免疫法檢測大鼠血中ACTH、CORT的含量；HE染色大鼠海馬觀察組織形態變化。結果：溫陽解郁湯能夠減少大鼠FST和TST不動時間，增加OFT穿格次數（P<0.05）；能夠降低由慢性應激引起的CRH、GR、ACTH、CORT水平升高（P<0.05），并能減少海馬組織損傷。結論：溫陽解郁湯能夠改善CUMS大鼠的應激抑郁行為和慢性應激時高糖皮質激素對大腦的損害，其作用機制可能與調節HPA軸有關。

關鍵詞：溫陽解郁湯；抑郁癥；下丘腦-垂體-腎上腺軸

抑郁癥作為一種特殊的精神疾病，具有一系列廣泛的癥狀，包括快感缺乏、無助、悲傷和絕望，并且被認為是與環境（例如應激或創傷）和遺傳因素有關。當機體處于應激狀態時，機體通過調節交感-腎上腺髓質系統和下丘腦-垂體-腎上腺軸（hypothalamic pituitary gonadal axis，HPA）使機體獲得穩定、恢復穩態，一定程度的應激對機體是有益的，但是長期應激，則可以引起抑郁癥的發生。HPA軸是重要的內分泌軸，是神經內分泌網絡的樞紐，對維持機體內環境的平衡起著至關重要的作用。研究表明，抑郁癥的發生與HPA軸功能的紊亂有密不可分的關系。中醫通過溫補腎陽、理氣解郁，對抑郁癥有很好的治療效果，在抑郁癥的治療中越來越得到重視。本研究建立經典的慢性不可預知溫和刺激（chronic unpredictable mild stress，CUMS）抑郁大鼠模型，研究溫陽解郁湯對抑郁模型大鼠HPA軸的影響，探究該方抗抑郁的機制。

材料與方法

1.  材料  180只SPF級雄性Wistar大鼠，初始體質量150-180g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，合格證號：11400700073683。鹽酸氟西汀分散片購自西班牙禮來公司，20mg，批號：4089A；皮質醇（cortisol，CORT）和促腎上腺皮質激素（adrenocorticotropic hormone，ACTH）放免試劑盒購自北京華英生物技術研究所；總RNA小量制備試劑盒購自愛思進生物技術有限公司；PCR引物由生工生物工程（上海）有限公司設計并合成；2×Easy Taq PCR Super Mix、Trans Script TM Green Two-Step q RT-PCR Super Mix、Trans DNA Marker I均購自北京全式金生物技術有限公司；其它實驗相關試劑均由山西省中西醫結合醫院中心實驗室提供。

2. 溫陽解郁湯濃縮煎劑制備  溫陽解郁湯組成藥物：桂枝、附子各15g，炙甘草10g，生姜、烏梅各30g，大棗5個；以上藥物按比例稱取，加入藥材重量10倍量70%乙醇溶液提取3次，第1次為1.5h，第2、3次分別為45min，合并提取液，減壓回收乙醇并濃縮至稠膏狀，減壓干燥成干膏并粉碎成細粉，過80目篩備用。

3. 分組、造模及給藥  將Wistar大鼠首先飼養7d以適應環境，最后1天用Supermaze視頻跟蹤分析系統進行Open-field行為學測定，選取評分相近的180只健康雄性大鼠，依照體質量隨機分為6組，每組30只。空白對照組和模型對照組大鼠灌胃0.9%氯化鈉溶液；溫陽解郁湯高、中、低劑量組分別灌胃溫陽解郁湯濃縮煎劑8、6、4g/kg（相當于生藥18.6、27.9、37.2g/kg）；陽性藥對照組灌胃鹽酸氟西汀（3.33mg/kg）。各組灌胃容量均為0.2m L/10g，灌胃28d。除正常對照組外，其余各組灌胃同時采用CUMS結合孤養刺激。選用夾尾（1min）、噪音（1h）、閃光（1h）、冰水游泳（4℃，5min）、潮濕墊料（100m L，24h）、傾斜籠具（30°，24h）、晝夜顛倒、禁食、禁水9種溫和刺激，于每日9：00和16：00隨機安排刺激方法，刺激28d。第29天進行行為學評價、取材和指標測定。

4. 大鼠行為學評價  本實驗采用的以下行為學實驗儀器均購自上海欣軟信息科技有限公司，強迫游泳實驗（forced swim test，FST）：大鼠游泳6min，記錄后4min內的累計不動時間；懸尾實驗（tail suspension test，TST）：大鼠夾尾懸掛6min，記錄后4min內累計不動時間；曠場實驗（open field test，OFT）：在敞箱內記錄大鼠5min內測定運動格數和理毛次數。

5. 血清CORT和ACTH水平的測定  行為學評價之后，每組取20只大鼠測定其血清CORT和ACTH水平。將大鼠迅速腹主動脈取血，置于離心管內，4℃ 4  000r/min離心10min，取血清，-20℃保存待測。采用放射免疫法檢測CORT和ACTH的含量。

6.  大鼠下丘腦促腎上腺皮質激素釋放激素（corticotropin-releasing hormone，CRH）m RNA及海馬糖皮質激素受體（glucocorticoid receptor，GR） m RNA表達水平  取血結束后，每組取10只大鼠，于冰盤中急速開顱取腦，剝離大腦下丘腦和海馬，-70℃保存。分別提取下丘腦和海馬總RNA，RT-PCR逆轉錄為c DNA。采用q PCR法檢測下丘腦CRH m RNA及海馬GR m RNA表達水平。根據Genbank中大鼠基因序列設計引物，CRH引物：上游：5’-AGC CGC CCA TCT CTC TGG ATC TC-3’，下游：5’-TCC CGA TAA TCT CCA TCA GTT-3’；GR引物：上游：5’-GAT TGA ACC CGA GGT GTT GTA TGC-3’，下游：5’-CGG CAA ATG CCA TGA GAA ACA TCC-3’；β-actin引物：上游：5’-GAG ACC TTC AAC ACC CCA GC-3’，下游：5’-ATG TCA CGC ACG ATT TCC C-3’。讀取Ct值，采用2-ΔΔCt計算CRH m RNA的相對表達水平。

7. 大鼠海馬蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色  行為學評價之后，每組取10只大鼠進行海馬組織HE染色。使用4%多聚甲醛心臟灌流法內部去血固定大鼠腦組織，開顱取腦，石蠟包埋，冠狀切片。取海馬組織切片進行HE染色，顯微鏡下觀察海馬組織病理變化。

8. 統計學方法  所有數據的統計學處理均在SPSS 19.0軟件包上進行。計量資料以x-±s表示，組內比較使用配對t檢驗，組間比較使用方差分析。計數資料采用構成比，組間比較用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

討論

抑郁癥作為一種多因素引起的精神疾病，與HPA軸功能失調有關，而以HPA軸為靶點的藥物能夠起到治療抑郁癥的作用。近年來，采用中醫溫陽解郁理論治療抑郁癥的研究屢見報道。中醫理論強調“陽主動”，腎陽作為一身元陽之根，主宰身之陽氣，而抑郁癥臨床總體以情緒低落、思維遲緩、主動性下降等“不動”表現為主，因此陽氣不足與抑郁癥發病存在密切關系。《素問·生氣通天論》曰：“陽氣者，若天與日，失其所折壽而不彰，故天運當以日光明”，“陽氣者，精則養神，柔則養筋”。強調了人體生命活動均有賴于陽氣的推動和溫煦作用，使人體陰陽相對平衡協調。溫陽解郁湯由鄭欽安《醫法圓通》之補坎益離丹化裁而來，方中“附子辛熱，能補坎中真陽，真陽為君火之種，補真火即是補君火也”，同時上助心陽、中溫脾陽；桂枝、生姜辛通心陽，疏肝氣，溫肝陽，補肝用；炙甘草、大棗甘緩其中，合辛甘化陽、酸甘化陰之意，同時“甘草補中有引火歸根之妙”，生姜、大棗溫中焦，助脾陽，烏梅統領陽藥入肝，溫補肝陽，使肝中陽氣得以升發，又可斂肝氣、養肝血以柔肝，正合肝“體陰而用陽”的生理特性。諸藥合用，復腎陽、補肝陽、暖心陽、運脾陽，收納微陽于腎，伏虛火于中，切合抑郁癥之病機。

本研究中構建的CUMS動物模型能夠表現出與抑郁癥患者相似的行為和激素水平的改變。采用FST、TST和OFT進行本方對大鼠行為影響的評價，結果顯示：模型對照組大鼠FST、TST不動時間延長，OFT穿格次數減少，與Cheng R F等研究結果相符；灌胃溫陽解郁湯濃縮煎劑后CUMS大鼠的行為遲滯現象得到改善，提示本研究選用的溫陽解郁方劑能夠起到緩解CUMS大鼠應急抑郁癥狀的作用。

本研究亦對HPA軸相關激素表達和分泌水平進行檢測，HPA軸由下丘腦、腺垂體和腎上腺皮質及其分泌的CRH、ACTH和CORT組成，當機體處于應激狀態時，HPA軸處于亢奮狀態，其中CORT發揮調節機體應對應激的作用，CORT同時作用于下丘腦和海馬的GR，下調CRH的分泌，從而下調HPA軸整體激素水平，使之恢復到基礎狀態。長期的慢性應激狀態下，過量CORT持續刺激GR，使GR與CORT結合能力下降，負反饋調節能力下降，導致HPA軸持續興奮。此外，持續高水平的CORT會導致海馬神經元受損。研究顯示：溫陽解郁湯能夠下調CRH、ACTH和CORT的水平，減少應激時高糖皮質激素對大腦的損害效應，提示該方劑可能通過調節HPA軸發揮抗抑郁作用。另外，該方劑能夠恢復抑郁大鼠海馬GR表達水平，提示該方劑通過保護海馬進而穩定HPA軸負反饋調節功能，這與岳廣欣等的研究結果相符。作為情感調節中樞重要的組成部分，其組織功能受損就可能引發抑郁癥。本研究中，海馬組織HE染色結果顯示：溫陽解郁湯濃縮煎劑在下調HPA軸激素水平的同時能夠起到保護海馬組織的作用。因此，溫陽解郁湯改善抑郁癥狀可能與保護海馬組織負反饋調節HPA軸能力，下調HPA軸激素水平有關，其機制還有待進一步研究。