高鹽飲食對更年期焦慮小鼠海馬鉀離子 - 氯離子共轉運體 2、鈉 - 鉀 - 氯離子失轉運體 1 表達的影響

【摘 要】目的 研究高鹽飲食對更年期焦慮癥小鼠鉀離子-氯離子共轉運體 2( KCC2) 、鈉-鉀-氯離子共轉運體 1( NKCC1) 表達的影響。方法 將大鼠隨機分為空白組、模型組、4% 高鹽飲食組、8% 高鹽飲食組。其中 4% 高鹽飲食組、8% 高鹽飲食組經高鹽飲食干預 1個月后，HE 染色觀察腦部結構，免疫組織化學觀察 KCC2、NKCC1 表達情況。結果 高鹽飲食使更年期焦慮小鼠海馬區錐體細胞排列紊亂，神經元數目明顯減少，細胞輪廓模糊，出現大量的空泡現象，細胞形態不規則，細胞間隙明顯增大; 模型組 KCC2 表達的陽性細胞明顯減少，高鹽飲食組陽性細胞極少; 模型組 NKCC1表達陽性細胞明顯增多，高鹽飲食組陽性細胞增多更明顯。結論 高鹽飲食加重更年期焦慮癥的發生可能與 KCC2 及 NKCC1 之間的動態平衡被打破有關。

〔關鍵詞〕 高鹽飲食; 更年期焦慮癥; 鉀離子-氯離子共轉運體 2; 鈉-鉀-氯離子共轉運體 1

更年期焦慮癥不僅影響患者的健康、社會關系、家庭生活等方面，還可引起其他精神障礙疾病，甚至產生自殺行為，且直接關系到老年期疾病的發生。因此其防治研究是臨床醫護人員乃至整個社會所面臨的重要任務。隨著年齡增長，人們味覺功能下降，在日常生活中表現為食物咸味重，研究表明我國人均吃鹽及人均每天食鹽攝入量均超標。本研究探討高鹽飲食對更年期焦慮小鼠鉀離子-氯離子共轉運體 2( KCC2) 、鈉-鉀-氯離子共轉運體 1( NKCC1) 的影響。

1 材料與方法

1. 1 實驗動物 選用 11 月齡的昆明雌性小鼠，清潔級，體重35 ～ 45 g，由長沙市開福區東創實驗動物科技服務部代購，動物合格證號: scxk( 湘) 2009-0012。飼料均來自于由長沙市開福區東創實驗動物科技服務部。

1. 2 試劑與儀器 羊抗鼠 KCC2、NKCC1 多克隆抗體購自美國Sigma公司。低溫大容量高速離心機( 型號: KDC-2046 低溫大容量離心機，中國科學技術大學科技實業有限公司) ; 電子天平( 型號: ES-C-600 電子天平，湘儀天平儀器有限公司) 。

1. 3 分組 連續 5 d 進行小鼠陰道涂片檢查，呈現不規則動情周期的小鼠為自然更年期小鼠。將 40 只更年期小鼠隨機分為空白組、模型組、4% 高鹽飲食組、8% 高鹽飲食組。分組后空白組和模型組小鼠繼續給予普通飼料，4% 高鹽飲食組小鼠予含 4% 的 Na Cl 高鹽顆粒飼料，8% 高鹽飲食組小鼠予含 8% 的Na Cl 高鹽顆粒飼料喂養，自由攝食，自由飲用自來水，連續 1個月。

1. 4 實驗儀器 ①高架十字迷宮模型②明暗箱③曠場實驗均由上海欣軟信息科技有限公司提供。

1. 5 HE 染色 實驗第 31 天取材，麻醉灌注取腦，4% 多聚甲醛固定，石蠟包埋，常規 HE 染色，脫水透明封固，制成切片，光學顯微鏡觀察。

1. 6 免疫組織化學 實驗第 31 天取材，麻醉灌注取腦，4% 多聚甲醛固定，經脫水、透明、包埋，選擇海馬部位冠狀位連續冷凍切片。以 SABC 法 進 行 免 疫 組 織 化 學: 加 入 0. 3% H2O210 min，3% 正常山羊血清封閉 10 min; 滴加一抗( 1 ∶ 100) ，過夜( 陰性對照組以正常羊血清替代一抗) ，加入羊抗兔 Ig G、SABC，室溫放置 2 h，PBS 沖洗鋪片，DAB 顯色劑顯色，脫水，封片。每只大鼠取 3 張切片，每張切片選取 3 個無重疊在顯微鏡( ×400) 下觀察海馬區 NKCC1、KCC2 的表達情況。

1. 7 統計學方法 組間比較行 t 檢驗。

2 結 果

2. 1 高鹽飲食對更年期焦慮癥小鼠腦部結構的影響

空白組海馬區細胞排列整齊，細胞核圓而大，核仁清晰可見，錐體細胞排列整齊，層次緊密; 模型組海馬區錐體細胞排列較紊亂，神經元數目減少，細胞輪廓較清晰，出現空泡現象，細胞形態不規則，細胞間隙相對增大; 高鹽飲食組海馬區錐體細胞排列紊亂，神經元數目明顯減少，細胞輪廓模糊，出現大量的空泡現象，細胞形態不規則，細胞間隙明顯增大，8% 高鹽飲食組表現比 4%高鹽飲食組更明顯。

2. 2 高鹽飲食對更年期焦慮癥小鼠腦海馬 KCC2 表達的影響

在高倍光學顯微鏡下，觀察細胞陽性著色情況，與空白組比較，模型組 KCC2 表達陽性細胞明顯減少，高鹽飲食組陽性細胞極少，且 4% 和 8% 高鹽組之間沒有明顯的差異。

2. 3 高鹽飲食對更年期焦慮癥小鼠腦海馬 NKCC1 表達的影響

在高倍光學顯微鏡下，觀察視野范圍內細胞陽性著色情況，與空白組比較，模型組 NKCC1 表達陽性細胞明顯增多，高鹽飲食組陽性細胞增多更明顯，但 4% 和 8% 高鹽組之間沒有明顯的差異。

討 論

合理的飲食結構是現代中醫護理中飲食護理的中心內容之一。目前提倡合理的飲食結構，雖根據每個人的機體狀況而有所不同，但總體而言首先應避免偏嗜。早古代醫家就已強調飲食不宜過咸，應少吃鹽�，F代文獻也報道食物與人的情緒有關，如多食咸味、甘味，使鹽、糖攝入過多，情緒容易激動。澳大利亞學者曾歷時 10 年的跟蹤調查結果顯示，飲食結構與抑郁、焦慮等精神紊亂之間存在密切的關系。KCC2 分布于神經元細胞膜上的轉運蛋白，是神經元細胞內氯離子外排的主要因素，使 Cl－由細胞內移向細胞外，降低胞內的 Cl－濃度; NKCC1 分布于上皮細胞和非上皮細胞膜上，則順著內向 Na 梯度促使 Cl－由細胞外移向細胞內，促進細胞內Cl－堆積，故 Cl－排出系統( KCC2) 及 Cl－聚集系統( NKCC1) 之間的動態平衡決定中樞神經系統中〔Cl－〕i。γ-氨基丁酸( GA-BA) 產生興奮性和抑制性作用之間的進行轉化的關鍵因素在神經元細胞 內 Cl－濃 度 差，而 功 能 相 反 的 氯 離 子 共 轉 運 體KCC2 / NKCC1 是中樞神經系統內調節 Cl－濃度差、調控 GABA效應轉化的關鍵因素。研究表明，KCC2 基因敲除的大鼠，其腦內 GABA 的抑制作用下降。NKCC1 mＲNA 表達增高及KCC2mＲNA 表達降低的變化可能引起神經元細胞內 Cl－濃度增高，Cl－梯度的崩潰，Cl－內流減少，細胞膜超級化減弱，從而導致 GABA 能抑制作用的減弱，神經元高興奮性，使癲癇易感性增加。課題研究前期采用 EPM、高架十字迷宮成功制備焦慮癥模型，且高鹽飲食可加重動物焦慮程度，減少其活動次數，本研究結果顯示高鹽飲食加重更年期焦慮癥的發生可能與高鹽飲食使細胞內外的 Na+、Cl－水平發生改變，KCC2 及NKCC1 之間的動態平衡被打破，但具體機制有待進一步研究。