介紹

在生物實驗中要經常要使用到的平行線分析（PLA）方法，當無法直接檢測一個生物制品的活性而只能通過檢測其產生的效果時，PLA方法通常會被用來進行效應曲線的比較來獲得此制品的效果（Figure1）。如果對于兩種物質其生物響應相似或者在兩種不同的生物環境中同一種物質產生相似的效應曲線時，平行線分析法可以被用來進行評價。評價平行性是計算化合物或藥物相對活性的前提，并且在很多生物應用中如藥物活性比較、分析物鑒定、交叉反應、干擾物質、基質補償、濃度估算和抑制效應等應用研究中。

當兩條曲線被判定為平行時，其中一條曲線的函數可以通過通過另一條曲線的函數乘上一個比例系數向X軸的左邊或右邊變換獲得：ƒ(x) = ƒ(rx), 其中x是劑量，r是比例系數或相對活性。對于相對活性，一般將參考品（已知品）的活性設為1，可以使用一個比例系數可以將參考品的曲線變換為測試品（未知品）曲線，那么這比例系數則被稱之為測試品的相對活性。這個方法應用于線性擬合的曲線非常合適，因為線性擬合的曲線在整個濃度范圍內的曲線斜率是保持一致的（Figure2）。可是對于非線性擬合曲線如4-參數和5-參數曲線，S形的濃度效應曲線在整個測試濃度范圍內具有變話的斜率值（Figure1）。

用于評價平行性的方法根據平行性假設的驗證方法不同大致可以分為兩大類：效應比較法和參數比較法。本文將對這兩大類方法進行詳細解釋和介紹怎樣使用SoftMax® Pro 7軟件進行平行性測試。我們建立了一個Protocol包括了使用F-檢驗進行F-檢驗概率測試和使用卡芳-檢驗進行卡芳概率測試。另外，對于參數比較法，根據菲勒定理我們也建立了一個Parallelism Test 的protocol放在SoftMax Pro Protocol的庫內。所有這些方法都可以被用于評價線性和非線性擬合曲線。

Figure 1. 使用約束型通用4參數曲線擬合進行效應曲線的平行線分析。

Figure 2. 線性回歸平行線模型。參考曲線的相對活性（紅色圈）設為1，用來變換參考曲線為測試曲線（藍色圈）使用的校正因子即是未知品的相對活性。

平行性檢測

效應比較法

生物系統經常會出現不符合預期的現象，并且數據會出現一些噪聲和波動；因此，選擇正確的曲線擬合方式和權重因子，來消除這些噪聲和波動是進行平行性評價前的首要一步。如果選擇了一個不合適的擬合方式，那么可能在平行性評價系統內引入偏差，進而得出錯誤的結論。

由于根據實際實驗中的數據，很難獲得完全平行的擬合曲線，尤其對于非線性擬合回歸，而計算非平行曲線獲得相對活性是很困難的。在效應比較法中，參考品和測試品的曲線會使用約束模型同時進行擬合，在這個模型中，曲線被強制變為平行；而在非約束模型中，兩條曲線會各自進行擬合。通過統計學的方法，來比較約束模型和非約束模型兩種擬合度的差異，這個差異可能是由于非平行性造成的。

在約束模型中，用來描述曲線的所有參數都是一樣的，除了用來描述X-值的參數不一樣；線性擬合中，X-值是指截距，非線性擬合中是指上、下漸近線之間的中值，也就是EC50值。SoftMax Pro軟件具有計算線性擬合的相對活性，也可以使用約束性模型（全局擬合模型）和獨立模型對非線性擬合曲線進行評價和計算相對活性。

虛假設測試

在效應比較法中，平行性的計算通常是利用殘差平方和（RSSE）的函數來進行的,以此來判斷約束性模型對數據的擬合效果，另外一個特殊的方法，則是根據附加平方和的分析來進行。這個統計學回歸方法是方差分析(ANOVA)的一種形式，其中虛假設的是約束性模型是正確的或者說曲線是相互平行的。虛假設的驗證，可以使用各種不同的統計學技術，包括概率的F-檢驗或卡方檢驗。在這兩種方法中，概率值會被計算出來，通常這個值介于0-1之間，當這個值接近1時，意味著曲線間的平行性在增大。需要注意的是，F-檢驗是有一定缺陷的，此法對于對獨立模型擬合度很高的曲線可能產生假陽性判斷或者對于獨立模型擬合度很低的曲線產生假陰性的判斷。這兩種方法都被收錄進了SoftMax Pro軟件當中，檢驗值和概率值計算可以通過軟件內的以下公式方便的獲得：

• ChiSquaredPLA (PlotName@GraphName): Returns the value of the chi-squared statistic for a reduced curve fit. 返回被擬合曲線的卡芳統計值

• ChiProbabilityPLA (PlotName@GraphSection): Returns the chi-squared probability distribution value for a reduced curve fit.返回被擬合曲線的卡芳統計值概率分布值

• FStatPLA(PlotName@GraphSection): Returns the value of the F-test statistic for a reduced curve fit.

返回被擬合曲線的F-檢驗值

• FProbPLA(PlotName@GraphSection): Returns the value of the F-test probability for a reduced curve fit.

返回被擬合曲線的F-檢驗值概率分布值

注：以上所有公式只有在曲線擬合選項設置中的Global Fit (PLA)選項被使用的情況下才可以使用。PlotName@GraphName是曲線的全稱，包含圖表的名稱，例如，Plot#1@Graph#1或Std@Standardcurve。指定某一條曲線作為公式內曲線是帶有主觀性的，實際上卡方值是從該圖表中的所有曲線數據計算而來的。

名稱為“Parallel Line Analysis Using F-test and Chi-squared Test”的模板，是根據這兩種統計學方法而建立的SMP模板。當使用儀器直接獲取到數據或者從外部導入數據到模板中后，所有的計算過程會自動進行，并進行零假設的評估，判斷曲線是否平行。

在這個模板中，F-檢驗和卡芳檢驗的概率值必須大于等于0.95才能認定曲線是平行的。一般來說，這個設置的意思是指有95%的置信度該假設是成立的。置信程度是可以被調整的以適應不同實驗的接受水平。

噪聲和權重

噪聲是指檢測響應的隨機變化，當進行平行線評價時這是需要考慮的重要因素，因為它會影響檢測平行性的能力。在高噪聲的情況下，平行性計算值由于由于受噪聲的影響過大，因此無法再正確的反應非平行性的程度。

對于F-檢驗和卡方檢驗法這兩種方法，在計算各自的概率值的過程中對于不同噪聲水平的處理能力是不同的。F-檢驗的概率值不受此因素影響，但是卡芳檢驗概率計算值則高度依賴于噪聲水平并要求對于數據方差進行準確的估算。因此，對于卡方檢驗法需要進行反方差權重設置。

如在“Selecting the best weighting factor in SoftMax Pro 7”此篇應用資料里討論的，生物實驗一般在在曲線的上半部分會有較大的方差。在無權重的回歸分析中，平行性的結果會主要受曲線的上半部分的數據點影響，而曲線的下半部分的數據點在對于平行性結果的影響不大。

在軟件的模板中，權重因子的設置使用方差的倒數，但是根據情況可以調整為更合適的權重公式。另外，在SoftMax Pro 6.5或更高版本中，可以直接進行方差的倒數權重項的設置(Figure 4G)。卡方檢驗方法中，參數的置信區間設置項(Figure 4H)只有在‘Weights are Inverse Variances’項被選擇的情況下才能使用。最佳的權重因子的設置會保證結果是主要來源于所有變化的數據點。

如何在SoftMax Pro使用PLA

在SoftMax Pro 7軟件中，PLA可以在除了“point-to-point“, ”log-logit“ 和 ”cubic spline“三種擬合方式之外的所有通用曲線擬合方式下使用。在圖表部分，所有曲線具有一個共同的曲線擬合方程，PLA的具體使用設置請見Figure 4。

參數比較法

與響應比較法直接評價不同劑量曲線下的響應差異不同，參數比較法會各自獨立地對非約束模型下的各個曲線的參數進行比較，并參考大概置信區間；參數對必須落在規定置信水平下的置信區間內。這種方法叫做等效測試和平行性小于規定閾值的測試法。歐洲藥典中使用的斜率比值法就是等效測試法的一個例子。

菲勒定理

菲勒定理使用統計學方法計算兩個參數比值的置信區間，使用tInv 函數進行比值的計算，因此遵循帶自由度的t-分布，其概率為p。SoftMax Pro軟件的統計學公式，可以計算參考曲線和測試曲線各自曲線擬合參數之間比值的置信區間，并建立了一個模板(Figure 5)包含了這些計算和概率閾值設定0.1（90%置信度），可做相應調整。為了判定參考曲線和測試曲線之間是否平行，需要將計算的置信區間與一定置信水平的固定置信區間進行比較；在此模板中，使用90%的置信水平，因此，計算的置信區間如果落在0.9~1.1之間，那么這兩曲線將被認定為平行。

對于線性擬合曲線，該測試會針對參考曲線和測試曲線的斜率值進行，也即SoftMax Pro軟件中所描述的曲線方程內的B參數值。可是，對于非線性擬合曲線，此方法只測試上平臺和斜率值，下平臺則由于菲勒定理的數學局限而不做測試。在低濃度時，參數的變異會非常高，導致中間計算過程會產生虛數，進而導致最終計算的置信區間不正確或無法計算。這個問題被美國農業部（USDA）的獸用生物制品中心建議將下平臺值固定為0，然后使用上平臺和斜率值來進行測試。相同地，SoftMax Pro 軟件的Parallelism Test的模板內，默認將下平臺值設為0，然后對斜率（參數B）和作為上平臺的參數A或D進行平行性結論的判斷。

Figure 3. 非線性回歸的平行線模型。相對活性的計算由曲線的線性區段的半效劑量效應EC50獲得，曲線使用約束性模型進行擬合，除了描述X-軸的參數外，各條曲線的4參數方程中的各個參數都是相同的。

Figure 4.如何在SoftMax Pro軟件中應用PLA和進行相對活性計算。選擇一個包含多個曲線的圖表，點擊home欄圖表工具中的曲線擬合設置項（A）；或者在圖表部分的上部的工具了項（B）；在曲線擬合項對話框內選擇GlobalFit（PLA）項（C）；在擬合下拉菜單內選擇除point-to-point, log-logit, 和cubic spline 三種擬合方式之外的任何擬合方式（D）；選擇一條曲線作為參考曲線（E）；如有必要的話，選擇相應的擬合參數和相對活性的置信區間（F）；如有必要，選擇相應的權重項，請參考“Selecting the best weighting factorin SoftMax Pro 7”中的關于如何在SoftMax Pro V版本6.5或更高版本中選擇方差倒數作為權重因子的設置方法（G）；如有必要，選擇統計學工具按鈕（H）；當所有曲線選項設置好后，點擊OK按鈕，曲線會自動被擬合到約束型模型中，除了描述X軸的參數外，描述各條曲線的參數是相同的如Figure 3.對于非線性擬合函數，所有曲線的最小和最大響應值（下平臺和上平臺值）也被約束為相同的值。

Figure 5. 在SoftMax Pro 7軟件中使用效應比較法進行平行性評價。初始的置信水平和概率分別設置為90%和0.1，但是可以根據情況做相應調整。當在此置信區間內參數比值的低值（rBCILower和rDCILower）和高值(rBCIUpper 和 rDCIUpper)分別被計算出來后，會被拿來與定義的置信區間標準值(lval 和 uval)進行比較，如果計算出來的置信區間值坐落在定義的置信區間范圍內，則認為參考曲線和測試曲線是相互平行的關系。