烏司他丁對異氟醚暴露致老年小鼠認知功能障礙的影響

【摘要】 目的 評價烏司他丁預先給藥對異氟醚暴露致老年小鼠認知功能障礙的影響。方法 健康雄性SPF 級 C57BL /6 小鼠 36 只，18 月齡，體重 27 ～ 35 g，采用隨機數字表法，將其分為 3 組( n = 12) ; 空白對照組 ( C組) 、異氟醚組( I 組) 、烏司他丁預先給藥組( S 組) 。I 組和 S 組暴露于 1% 異氟醚 3 h，連續 7 d; S 組于異氟醚暴露前 30 min 腹腔注射烏司他丁 50 000 U/kg。末次暴露結束后 24 h 進行認知功能測試，包括 Morris 水迷宮和曠場實驗測試，測試完畢后立即處死小鼠取海馬，采用 ELISA 法測定白細胞介素 － 6( IL － 6) 、白細胞介素 － 1β( IL － 1β)和腫瘤壞死因子 － α( TNF － α) 含量。結果 與 C 組比較，I 組逃避潛伏期延長，原平臺停留時間和穿越平臺次數減少，曠場中心區停留時間縮短，海馬 IL － 1β、TNF－ α 含量升高( P ＜ 0. 05) ，S 組上述指標差異無統計學意義( P ＞ 0. 05) 。與 I 組比較，S 組逃避潛伏期明顯縮短，原平臺停留時間和穿越原平臺次數增多，曠場中心區停留時間延長，海馬 IL － 1β、TNF － α 含量降低( P ＜ 0. 05) 。結論 烏司他丁預先給藥可改善異氟醚暴露所致老年小鼠認知功能障礙，其機制可能與抑制海馬炎癥因子過度釋放有關。

【關鍵詞】 異氟醚; 烏司他丁; 老年鼠; 認知障礙; 海馬; 炎癥

術后認知障礙( POCD) 是老年患者術后常見的并發癥之一。研究表明，異氟醚可導致 POCD。因此探尋有效措施預防和治療異氟醚導致的認知功能障礙具有重要意義。烏司他丁是從人尿液中分離純化的廣譜蛋白酶抑制劑，可減少炎癥介質的過度釋放。研究表明，烏司他丁具有神經保護作用，但其能否有效地防治異氟醚所致認知功能障礙尚不明確。本研究擬評價烏司他丁預先給藥對異氟醚暴露致認知功能障礙的影響。

1 材料與方法

1． 1 實驗動物 健康雄性 SPF 級 C57BL /6 小鼠 36只，18 月齡，雄性，體重 27 ～ 35 g，由中山大學實驗動物中心提供，于室內溫度 22℃ ，濕度 50% ，12 h/12 h 晝夜明暗交替的環境中飼養。采用隨機數字表法，將其分為 3 組( n = 12) ; 空白對照組( C 組) 、異氟醚組( I 組) 、烏司他丁預先給藥組( S 組) 。

1． 2 方法 參照文獻［4］的方法并加以改進，將小鼠置于密閉麻醉箱中，頂蓋一小孔與氣體監測儀的導管相通，持續監測箱內異氟醚、CO2和 O2的濃度。麻醉箱底部浸于 37℃ 的恒溫水浴箱中。I 組和 S 組暴露于1% 異氟醚( 批號: 936245U，Abbott 公司，美國) 3 h，異氟醚以空氣( 21% 氧氣混合 79% 氮氣) 輸送，新鮮氣體流量 1. 5 L/min，連續 7 d; C 組吸入空氣 3 h; S 組于異氟醚暴露前 30 min 腹腔注射烏司他丁 50 000 U/kg。

1． 3 Morris 水迷宮實驗和曠場試驗（儀器均由上海欣軟信息科技有限公司提供） 末次暴露結束后 24 h 進行 Morris 水迷宮實驗和曠場試驗。在定位航行實驗中，記錄小鼠游泳速率和潛伏期。在定位航行試驗第 4 天完成之后行空間探索試驗。此時平臺從第Ⅰ象限移除。小鼠從定位航行實驗平臺放置象限相對的象限即第Ⅲ象限入水，每次進入小鼠游泳 60 s 后停止。記錄目標象限穿越次數和目標象限停留時間。曠場試驗持續 3 d。從小鼠放置在中央格時計時，每次記錄 15 min。記錄中央區停留時間、周邊區停留時間、總路程及平均速率。

1． 4 白細胞介素 － 6 ( IL － 6 ) 、白細胞介素 － 1β( IL －1β) 和腫瘤壞死因子 － α( TNF － α) 含量測定 認知功能測試完畢后立即處死小鼠，剝離雙側海馬組織，存于－ 80℃ 冰箱，采用 ELISA 法測定海馬 IL － 6、IL － 1β 和TNF － α 含量。稱重海馬，稀釋至 400 μL，按試劑盒說明書步驟操作，根據標準品的濃度以及相對應的吸光值( OD450值) 通過 Curve Expert1． 3 軟件分析作出標準曲線圖，根據酶標儀檢測得到樣品的，利用標準曲線的方程式計算海馬 IL － 6、IL － 1β 和 TNF － α 含量。

1． 5 統計學方法 采用 SPSS 16. 0 統計軟件，計量資料組間比較采用成組 t 檢驗。

3 討論

探討圍手術期 POCD 發生的原因，以及避免和防范 POCD 成為亟待解決的問題。18 月齡的 C5 /7 小鼠相當于人類中老年期，因此本研究選用 18 月齡鼠作為研究對象，以期了解異氟醚對老年鼠學習記憶的損害。根據 ＲAMMES 的研 究，小 鼠 異 氟 醚 MAC 值 在( 1. 33 ± 0. 16) % ，因此本研究采用 1% 異氟醚濃度 3 h麻醉暴露方案。

Morris 水迷宮是應用于腦學習記憶機制研究的一種實驗手段，在學習記憶﹑新藥研發﹑海馬 /外海馬研究﹑藥理學﹑毒理學等應用非常普遍。曠場試驗是一種經典評價動物行為學的實驗模型，主要反映動物在新環境的自主行為和探究行為。本研究中 Morris 水迷宮結果和曠場試驗結果提示，I 組老年小鼠的學習記憶能力和空間探索能力均較對照組降低，而 S 組與 C 組差異無統計學意義，說明烏司他丁可減輕異氟醚暴露所致老年小鼠學習探索和記憶能力的損傷。

本研究結果表明，烏司他丁預先給藥可改善異氟醚暴露致老年小鼠認知功能障礙，其機制可能與減少海馬炎性因子的過度釋放有關。神經細胞炎性因子( IL － 1β、TNF － α 和 IL － 6 等) 釋放能夠導致認知功能減退。炎性因子釋放可抑制海馬長時程增強，而海馬長時程增強是海馬學習記憶的關鍵。另外，IL － 1β能夠激活 Caspase － 3，從而導致神經元凋亡，可通過IL － 1β / Caspase － 3 / 神經凋亡途徑損害認知功能。而烏司他丁能調節全身炎癥反應，抑制促炎性細胞因子的釋放、促進抗炎性細胞因子的釋放。烏司他丁是從人尿液中分離純化的廣譜蛋白酶抑制劑，可有效抑制多種蛋白酶、糖苷酶、脂水解酶的活性。在膿毒癥、休克及心、肺、肝、腸的缺血再灌注損傷中，烏司他丁具有明顯的抑制炎癥因子釋放、保護組織臟器功能的作用。有研究表明在腦缺血再灌注模型的體內外實驗中，烏司他丁能夠減少腦缺血再灌注損傷。另一項研究證實，在神經病理性疼痛模型中，烏司他丁可抑制 IL － 1β、TNF － α 等炎癥因子釋放，拮抗炎性因子造成的慢性神經病理性疼痛。本研究結果表明，與對照組比較，I 組海馬 IL － 1β 和 TNF － α 含量升高，提示異氟醚麻醉可促進老年小鼠海馬炎性反應，導致其認知功能降低。機制可能與異氟醚導致細胞內鈣離子濃度升高，激活 NF － κB 信號轉導通路，促進炎性反應有關。而烏司他丁預先給藥組促炎性細胞因子IL － 1β、TNF － α 的濃度明顯降低，可明顯減輕與神經炎性反應相關的神經認知功能損傷。