高架十字迷宮實驗相關文獻-高壓氧對大鼠行為學及應激相關指標影響的研究

【摘要】 目的通過對大鼠行為學及應激相關指標的觀察，探討高壓氧與應激的關系。方法20只Wistar大鼠按照數字表法隨機分為高壓氧組和空白對照組，高壓氧組給予0．20 MPa高壓氧處理，連續(xù)治療3周；對照組單純喂養(yǎng)，分別在第l、7、14、21天對其進行高架十字迷宮試驗，觀察大鼠開臂逗留時間，利用酶聯(lián)免疫吸附測定法測定其血清中促腎上腺皮質激素釋放激素、促腎上腺皮質激素、糖皮質激素、一氧化氮合酶、一氧化氮及腫瘤壞死因子．a(TNF．d)含量。結果高壓氧處理可明顯增加大鼠外周血液中糖皮質激素(glucocorticoids，GCS)的水平，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0．05)，但對大鼠高架十字迷宮中的開臂逗留時間、一氧化氮系統(tǒng)及TNF．0【的表達無明顯影響(P>0．05)。結論高壓氧處理符合慢性應激的一般特征，但又不對機體造成明顯的不良影響，提示高壓氧的作用機制之一是作為一種良性應激來增加機體對應激的耐受能力。

【關鍵詞】高壓氧；高架十字迷宮；HPA軸；一氧化氮系統(tǒng)；腫瘤壞死因子一Ot；大鼠

高壓氧治療在臨床應用十分廣泛，涉及臨床諸多學科，腦外傷后恢復期、突發(fā)性耳聾、脊髓損傷及糖尿病足等疾病的治療，其治療過程中壓力及呼吸氧氣濃度的變化對于機體來說屬于一種應激事件，因此長時間連續(xù)的高壓氧處理有可能成為慢性應激源，所以了解高壓氧對機體的影響對臨床治療十分重要。為此筆者設計了本實驗，通過對大鼠的行為學、下丘腦．垂體一腎上腺皮質(HPA)軸、血清中一氧化氮系統(tǒng)及促炎癥因子等進行觀察，以探索高壓氧對機體應激的影響。

材料與方法

1．實驗動物與處理：8周齡雄性Wistar大鼠20只，體質量200—250 g，購自軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心。熟悉環(huán)境7 d，按數字表法隨機平均分成2組：單純高壓氧組及空白對照組。單純高壓氧組：每天上午9：00—10：00，0．20 MPa，100％氧濃度，升壓時間10 min，穩(wěn)壓60 min，減壓時間15 min，連續(xù)治療21 d；空白對照組：單純飼養(yǎng)21 d。實驗動物自由進食飲水，每天12 h光照。

2．高架十字迷宮試驗：高架十字迷宮(由上海欣軟信息科技有限公司提供）：高35 cm，2個開臂(open arm，OA)及2個閉合臂寬10 cm長50 em，閉合臂壁高25 cm，內側及底部涂黑，高架十字迷宮上方約1 m處設有照明用500 W燈及攝像頭。實驗過程：每次試驗前轉移動物至高架十字試驗室，熟悉環(huán)境10 min，實驗動物背向操作人員置于高架十字迷宮中心，面向開臂，記錄大鼠5 min的活動…。下次試驗前用清水消除實驗動物氣味。高壓氧組及空白對照組動物在熟悉環(huán)境1周后，分別于第1天、第7天、第14天及第21天作高架十字迷宮試驗。實驗結果以開臂逗留時間及開臂穿越數作統(tǒng)計。

3．麻醉及取材：實驗動物在完成高架十字迷宮試驗后，單純飼養(yǎng)1 d，于上午9：00—12：00期間給予20％烏拉坦0．7 ml／100 g腹腔注射麻醉，肌肉完全松弛及角膜反射存在為麻醉成功標志。開腹，暴露腹主動脈，10 ml注射器取血，促凝管搖勻，以1 000 r／min離心10 min，離心半徑r=15 cm，取上清液，一20℃保存。

4．血清標本指標的測定：通過酶聯(lián)免疫吸附測定法(enzyme．1inked immuno sorbent assay，ELISA)測定血清中促腎上腺皮質激素釋放激素(corticotropin releasing hormone，CRH)、促腎上腺皮質激素(adrenocor ticotropic hormore，ATCH)、糖皮質激素(glueocorticoids，GCS)、一氧化氮合酶(nitricoxide synthase，NOS)、一氧化氮(nitric oxide，NO)及腫瘤壞死因子一o【(tumor necrosis factor，TNF-d)含量，試劑盒購自碧云天生物技術研究所，使用MULTISKAN EX酶標儀檢測。

5．統(tǒng)計學處理：數據以SPSS 13．0軟件進行統(tǒng)計分析。原始數據用均數±標準差(元±s)表示，利用重復測量觀察組間及組內是否存在差異。排除性檢驗水準設為僅=0．05，納人性檢驗水準設為d=0．1。P<0．05表明差異有統(tǒng)計學意義。

討 論

慢性應激的致病過程是復雜的，有研究認為其致病過程主要由GCS抵抗舊J、HPA軸負反饋障介導，而外周循環(huán)中促炎癥因子及外周GCS的增加作為其終末效應很有可能是慢性應激的最終致病途徑，其中炎癥因子的增加可以促使NOS及NO表達的下降Hj，并有可能誘發(fā)動脈粥樣硬化的出現。

循環(huán)炎癥因子增加最突出的表現就是病態(tài)行為，如探索欲下降、攝食及運動減少，困倦以及認知功能的下降。所以本實驗首先通過觀察大鼠焦慮行為的變化，初步評價高壓氧導致大鼠當次應激的程度。高架十字迷宮首先由File等于1985進行描述，主要通過觀察實驗動物開放臂及閉合臂逗留時間評估實驗動物對外界的探索欲望，從而對其焦慮程度進行評估，有學者發(fā)現其對焦慮程度的評價相對于曠場試驗要直接與準確。本實驗可以看出，高壓氧組大鼠的焦慮程度與空白對照組差異無統(tǒng)計學意義，提示高壓氧處理在3周內可能并不會增加實驗動物的焦慮程度。除此之外，本實驗還發(fā)現第2周后高壓氧組大鼠的開臂逗留時間開始減少，其原因可能為應激時間的長短所導致的，如同樣的慢性束縛應激，不同的束縛時間導致了曠場試驗結果的差異，高壓氧也是如此，高壓氧處理時間不一，其行為學表現也可能不同。提示高壓氧治療在應激損傷方面可能存在一個累積的效應。從本實驗的結果出發(fā)，筆者推測高壓氧治療的療程應維持在2—3周內，但是上述推論仍需通過進一步延長實驗時間及增加樣本量來明確。

HPA軸負反饋障礙作為應激致病的核心，主要表現為應激過程中HPA軸持續(xù)興奮，即循環(huán)CRH、ATCH及GCS的增加。在慢性應激人群如抑郁癥患者¨¨及慢性應激的動物模型¨糾中均可觀察到這一現象。本實驗觀察到接受連續(xù)高壓氧處理的大鼠其HPA軸上游的CRH及ATCH并無差別，但是其GCS水平明顯提高，提示高壓氧處理雖然出現了糖皮質激素的上升，但與一般的慢性應激不同。而這種HPA軸上游激素變化與GCS變化的不對稱，說明了此時下丘腦一垂體段HPA軸負反饋通路是正常的。本實驗出現的這種現象考慮與應激強度有關。在f臨床研究中可發(fā)現處于慢性應激狀態(tài)中個體的ACTH及CRH mRNA表達下降，但血清GCS的水平卻持續(xù)升高，如Cotella等¨引對母愛剝奪人群的研究。另外慢性束縛應激，這類輕微的應激源同樣可以導致實驗大鼠外周持續(xù)高水平的GCS但并不表現出CRH及ACTH的上升¨引。結合本實驗結果，推測HPA軸負反饋功能的異常可能僅存在于強度高持續(xù)時間長的應激事件之中。而高壓氧可能屬于一種輕微的應激，并不會對HPA軸的反饋功能造成損害。另外高壓氧雖然其HPA軸負反饋功能保持正常，但是GCS的水平還是表現出明顯的上升，推測其原因可能出現在腎上腺皮質上。有實驗證明慢性應激并不會導致腎上腺皮質對ACTH的敏感性增加，提示GCS的水平持續(xù)升高則可能與其他因素相關，如腎上腺皮質的增生及肥大，導致其對ACTH刺激所分泌的GCS的量的增多¨6|。實驗結束時，對大鼠的解剖也發(fā)現了高壓氧處理組腎上腺的體積明顯大于空白對照組，但是本實驗并沒有繼
續(xù)就此推論繼續(xù)對腎上腺進行稱質量及病理學觀察，此為本實驗一個不足之處。

一氧化氮系統(tǒng)特別是血管一氧化氮系統(tǒng)受損在機體主要表現為內皮介導的血管舒張障礙，使得血管在血壓變化時的自我調節(jié)能力降低，間接促進了內皮損傷的出現。內皮損傷結合多種因素最終導致了動脈粥樣硬化的形成¨7|。循環(huán)炎癥因子的增加作為慢性應激致病的直接途徑之一，表現為循環(huán)IL一1、IL-6、TNF—d等的增加，此類炎癥因子的增加可使緩激肽介導的血管舒張發(fā)生障礙、血管一氧化氮合酶(eNOS)的mRNA表達及蛋白含量下降，最終使H：O：表達上升，介導氧化應激¨8|。所以慢性應激對一氧化氮系統(tǒng)的影響主要來自于促炎因子的作用。故本實驗嘗試利用對一氧化氮系統(tǒng)及促炎癥因子TNF．Ot的觀察，評價高壓氧治療中出現的應激損傷的程度。本實驗觀察到高壓氧雖然是一種應激源。但是與空白組相比NOS及NO的含量差異無統(tǒng)計學意義。提示高壓氧處理可能并不會對大鼠的內皮NO系統(tǒng)產生影響。另外高壓氧組中作為慢性應激致病原因之一的TNF一僅較空白組的低，雖無統(tǒng)計學意義但存在明顯趨勢，提示高壓氧或能降低循環(huán)促炎癥因子的合成。其中作為與交感神經拮抗的副交感神經被認為與交感介導的能量分布及系統(tǒng)炎癥反應相拮抗，而為保證獲得性免疫的強度，在炎癥過程中其活性常被抑制019]，同時高壓氧治療中一個特點就是副交感神經的興奮性增加，所以本實驗推測TNF—a的降低可能通過副交感神經的興奮，利用其抗炎作用，促使循環(huán)促炎因子下降，但上述推論仍需進一步實驗的證明。

綜上所述，本實驗從應激的角度出發(fā)，觀察到連續(xù)高壓氧處理具備了慢性應激的一般特征，如循環(huán)GCS的提高；但另一方面其又不像一般慢性應激那樣能明顯增加機體的焦慮程度，同時還或許能夠通過提高副交感的活性抑制炎癥因子的產生、降低TNF．0【甚至其他促炎癥因子的表達來使機體抵抗其他應激源造成的損害。

適當的應激能夠加強機體對外界應激的抵抗能力，Ostrander等㈣1發(fā)現處于慢性應激恢復期的大鼠在接受新類型的刺激后表現出GCS、ACTH水平及室旁核CRH mRNA的下降。說明了大鼠對應激是有適應性的，故能否達到有效的適應能力，而且在此之間并未對機體發(fā)生損傷可能就是良性應激的界定標準。而本實驗所初步觀察到的結果提示，連續(xù)的高壓氧治療對機體來說具備了作為良性應激的前提，即可能對機體沒有造成過多的損傷甚至能降低其他應激源的損害，但是否能作為良性應激被利用還需要進一步實驗的驗證。