最新生物標志物biomarker檢測技術進展（三）
ELISA酶聯免疫分析
ELISA（酶聯免疫分析）是很早被應用于體液樣本臨床蛋白標志物檢測的技術，因而也被當成“金標準”來使用，但事實上受制于較簡單的實驗范式和有限的優化措施，ELISA技術的靈敏度非常有限。而ELISA由于其使用抗體的不同，結果也會體現不同的檢測效力。粗制多克隆抗體，親和純化的多克隆抗體，和單克隆抗體都在ELISA中有廣泛的應用。在構建試劑盒時經常會需要對抗體的特異性，靈敏度等進行測試。應用不同的樣本進行同一個抗體的Western Blot測試可以幫助我們判斷抗體的特異性。對各種來源的抗體進行比較和優化，對于開發ELISA試劑盒，起到最為基礎的作用。
Multiplex多重標志物檢測技術
ELISA技術已經非常成熟且容易掌握，但其靈敏度和檢測通量較低的問題吸引研究者的關注，并嘗試開發更好的技術來替代這種傳統方法。由于大量獲取較廉價數據的需要，亦或是在樣本量有限而需要獲得較多數據時，多因子或多重分析物同時鑒定的技術對研究者意義重大。
代表性的多重生物標志物檢測技術包括平面矩陣式檢測和液相懸浮芯片。平面矩陣式檢測以R&D等公司的固相蛋白芯片為代表，通過在固相芯片的不同位置免疫捕獲不同的標準品或者樣品，來利用空間位置實現不同樣本的識別，而酶標二抗所產生的顯色反應強弱報告了每個樣本點的特定分析物含量，儀器通過簡便的讀卡就能判斷不同分析物的含量。固相蛋白芯片分析重數較低以及動力學范圍較窄的特性使得這項技術的應用受到一定限制，更適合于定性檢測或者相對含量的判斷。
液相懸浮芯片以Luminex平臺為代表，BD等公司的CBA技術也可以歸為此類。Luminex液相懸浮芯片采用的紅色-紅外雙色/三色染料混合熒光編碼，可以實現約100種/500種不同身份微球的識別。當把特定顏色的微球與檢測特定指標的抗體偶聯起來以后，不同微球就可以在同一份樣本中獨立工作，去分別捕獲不同的標志物。該技術所使用的二抗仍然是標志物特異性的，上面帶有生物素標記，可以同鏈霉親和素-藻紅蛋白顯色劑結合。因此這項技術的研發關鍵也是要有針對同一抗原分子不同表位的抗體對。在檢測結果時，與同一份樣本孵育的不同微球會被兩束獨立工作的激光照射。紅色激光用來識別微球的身份，從而告訴儀器正在檢測的是哪種指標。另一束綠色激光激發藻紅蛋白，從而依靠熒光產量判斷分析物含量。CBA與Luminex有較為類似的編碼方式，不同之處在于使用同一束激光來既判斷微球身份，又判斷分析物含量。在熒光補償，儀器調整方面對操作者提出了更高要求。受制于物理特性，試劑盒檢測分析物的重數也比較少，一般在10重左右。與此相對，得益于兩束激光的協同工作，Luminex能把物理干擾減到更低的程度，理論上做到500重的同時檢測都可實現。開發多重檢測試劑盒的瓶頸不再是光學特性，而是不同抗體的交叉反應。盡管人們嘗試各種辦法盡量減低不同抗體對（antibody pair）的交叉反應，但在實際的試劑盒開發工作中，如果堅持對數據質量較高的要求，最高可接受的檢測重數大約在40重左右。當液相懸浮芯片應用于核酸檢測的時候，由于無需考慮抗體造成的交叉反應，檢測重數可以大大增加。
液相懸浮芯片在實際的檢測工作中具備明顯而有力的價值。首先，液相懸浮芯片在取得接近于ELISA靈敏度的同時，有較大的檢測范圍（實際在3.0-4.5之間），具備較好的檢測效力。其次，在低至25微升樣本中可實現多達40重不同指標，能解決大量研究中都會遇到的樣品量和數據量之間的矛盾。再次，較低的檢測價格和較少的勞動力投入提高了該技術受使用者歡迎的程度。最后，在同一份樣品中檢測不同指標可以很好的進行樣品內不同指標的內參對照，得到具備獨特價值的數據。液相懸浮芯片的不足之處在于靈敏度相對ELISA并無根本突破，而且多指標檢測時不同反應相互干擾會帶來潛在的數據風險。因此，對于數據要求較高的項目，特別是藥物研發等醫藥研究領域，液相懸浮芯片的弱點常常無法忽視。
