銳賽小課堂0625-107
一、實驗流程
制備慢病毒表達質粒及其輔助載體，四個質粒共轉染293T細胞，轉染后6h更換為完全培養基，培養48和72h后，分別收集富含慢病毒顆粒的細胞上清液，病毒上清液通過超離心濃縮病毒。

二、實驗材料
慢病毒載體包裝系統為四質粒系統， 組成為Gag/pol、vsvg、rev及pLenti-X-EGFP表達載體。Polo3000轉染試劑等。

三、包裝細胞293T 細胞的培養
（一） 293T 細胞的凍存
隨著傳代的次數增加，293T 細胞會出現生長狀態下降、突變等。為了防止此類現象的出現，我們需要在開始就對細胞進行大量凍存，以保證實驗的穩定性和持續性。在細胞對數生長期進行凍存，增加細胞復蘇成活率。
1、去掉上清液，加入PBS 洗去殘留的培養基；
2、加入0.05%的胰酶，消化半1min 后，鏡下觀察細胞變圓，細胞間間隙加大時，去除胰酶，加入新鮮培養基吹打混勻，移入離心管中。
3、細胞計數，將細胞全部晃下，加入 2mL 37 ℃ 預熱的 10％DMEM，用 10mL 移液管進行吹打，較大力吹打 6-8 次即可，不留死角，之后，將所有細胞吸出，置于15mL 離心管中，取 50ul 混勻后的細胞于 1.5mL eppendorf 管中，加 入 450ul 10％ DMEM，即為10 倍稀釋，混勻，取 10ul 細胞于計數板 中計數。計數板上共 4 大格，每大格 16 小格。計數時，4 大格均計 數，總數除以 4（得每大格細胞數），再乘以 10（10 倍稀釋），即 為實際 n 萬/mL 細胞濃度。
4、細胞離心，1000rpm，5min。去掉上清。
5、根據細胞計數結果加入細胞凍存液（70%完全培養基+20%FBS+10%DMSO）,重懸細胞，密度為4 x 106 個/ml。
6、分裝進細胞凍存管，放入凍存盒中，放入-80℃超低溫冰箱。
7、第二天將細胞放于液氮罐中長久保存。
（二）293T 細胞的傳代
當細胞生長到匯合率達到 80%~90%時需要對細胞進行傳代操作，以擴大細胞數量，維持細胞良好的生長狀態。
1、消化細胞，方法同細胞凍存。
2、細胞離心結束后，加入完全培養基重懸。
3、根據具體情況，將細胞分到10cm 培養皿中，每個培養皿補足到10ml 培養基。

4、將培養皿平穩放回37℃、5%CO2 的培養箱中培養。
（三）293T 細胞的復蘇
當細胞傳代次數過多，細胞狀態變差時，或者細胞出現污染事故時，需要丟棄并對最初凍存的細胞進行復蘇。
1、設置溫度為37℃的水浴。
2、查看細胞庫記錄，根據記錄從液氮罐中取出凍存的細胞（需戴上棉手套，防止被凍傷），迅速丟入水浴鍋中并快速晃動，盡量在1min 內使細胞溶液完全溶解。
3、將細胞溶液轉移到5ml 離心管中，并在其中加上1ml 新鮮的完全培養基，混勻后離心，1000rpm，5min。
4、去掉上清，加入2ml 新鮮的完全培養基，混勻沉淀后，轉入6cm 培養皿。
5、將培養皿平穩放入37℃、5%CO2 和95%相對濕度的培養箱中培養。
6、第二天觀察細胞存活率。給細胞換培養基。以后每天觀察細胞生長情況。

四、慢病毒包裝和濃縮
（一）293T 細胞培養
將細胞調整合適狀態，在70%密度左右進行質粒共轉染。轉染前將細胞培養液換成無抗生素培養基。

（二）轉染
將轉染試劑Polo3000與基本培養基混合（用量請參考Polo3000試劑說明書），質粒DNA與基本培養基混合，室溫孵育5min后將兩者混合，放入37度培養箱孵育15min。再將混合液加入細胞培養皿中，混勻，細胞放入培養箱繼續培養。轉染后6h 換新鮮培液。
（四）病毒收集
轉染后48 和72h 分別兩次收集病毒上清)，收集后以0.45 μm 濾器過濾,于4℃，72000g/min 離心120 分鐘；
（五）病毒重懸和保存
1ml PBS 重懸病毒沉淀，一周內使用則置于4 度冰箱保存，如需長時間存放需置于-80 度保存。
五、感染目的細胞
不同細胞的MOI 不同，在病毒感染目的細胞前，需要做預實驗以確定細胞最佳MOI以及是否需要加入輔助增強劑Polybrene。
（一）細胞準備
將狀態良好的目的細胞接種到24 孔板，使細胞濃度為2×105/ml細胞，接種細胞數量因細胞的生長速度而略有不同，一般是保證第二天進行病毒感染的時候細胞匯合率在50%左右。
（二）感染
一組添加polybrene， 另一組不加。MOI=10～50 內，每個MOI 值加2個孔，加入感染增強劑polybrene的一組使polybrene 最終濃度為8ug/ml, 24 小時后換液。（具體加入的病毒數可參考附表）
（三）48 小時后觀察熒光表達情況,確定細胞的MOI 值及是否需要加入Polybrene。