多肽是分子結構介于氨基酸和蛋白質之間的一類化合物,由一種或多種氨基酸按照一定的排列順序通過肽鍵結合而成。多肽是構成蛋白質的結構片段,也是蛋白質發揮作用的活性基團,是人體進行代謝、調控活動的重要物質。蛋白質主要以多肽形式吸收,透過多肽既可深入研究蛋白質的性質,又為改變和合成新的蛋白質提供了基礎材料。研究多肽結構與功能的關系,有助于了解多肽中各氨基酸系列的功效,以便應用中設計盡可能短的多肽同時提高其生理活性,減少臨床的不良反應。隨著美國FDA1999年開始允許大豆蛋白制品標注可以預防心血管疾病的功能和人們對多肽中各氨基酸系列的功效的不斷了解,作為藥物和營養品的多肽產品不斷被開發出來,多肽的研發已成為近年生命科學研究的一大熱點[1~7]。

　　1 多肽的合成

　　1.1 多肽合成的分類

　　多肽合成主要有兩條途徑:化學合成和生物合成。化學合成主要通過氨基酸縮合反應來實現。為得到具有特定順序的合成多肽,當合成原料中含有官能度大于2的氨基酸單體時,應將不需要反應的基團暫時保護起來,然后再進行連接反應,以保證合成的定向進行。

　　多肽的化學合成有固相合成和液相合成之分,其主要的區別在于是否使用固相載體。多肽液相合成主要有逐步合成和片段組合兩種策略,逐步合成簡潔迅速,被用于各種生物活性多肽片段的合成;片段組合法為合成含100個以上氨基酸的多肽提供了最有前途的路線,并已成功地合成了多種有生物活性的多肽,其最大的特點是易于純制。1963年,Merrifield創立了固相合成法,將氨基酸的C末端固定在不溶樹脂上,然后在此樹脂上依次縮合氨基酸、延長肽鏈。固相合成法又可分為Boc(叔丁氧羰基)法和Fmoc(9-芴甲基氧羰基)法。在傳統液相和固相合成多肽方法的基礎上,人們又發展了氨基酸的羧內酸酐(NCA)法、液相分段合成法、組合化學法等。

　　在生物合成多肽方面,除了常用的發酵法、酶解法外,隨著生物工程技術的發展,DNA重組技術也被應用于多肽合成。

　　1.2 氨基酸的羧內酸酐法[8,9]

　　氨基酸的羧內酸酐是氨基酸的一種衍生物,它的氨基保護基也活化羧基。NCA法屬于陰離子開環聚合機理,其引發劑可選用多種親核試劑或堿類。采用NCA法合成多肽的基本反應包括:在堿性條件下,氨基酸陰離子進攻NCA形成較為穩定的氨基甲酸根離子,在酸化時該離子失去二氧化碳生成二肽。生成的二肽又進攻其它的NCA,如此反復進行下去(圖1)。

　　NCA法具有合成周期短、操作簡單、成本較低、產物分子量高等優點,在目前多肽合成中所占比例較大,技術也較為通用。但是,采用NCA逐步法只能合成短鏈多肽片段[9]。

　　1.3 液相分段合成法[10~19]

　　液相分段合成法是多肽片段在溶液中依據其化學專一性或化學選擇性,自發連接成長肽的合成方法,其優點是能得到長肽,但技術還不完善。常用的連接技術主要有:天然化學連接[11]、化學區域選擇連接[12,13]、可去除輔助基連接[14]、光敏感輔助基連接[15]、施陶丁格連接[16,17]和正交化學連接[18,19]。

　　天然化學連接方法(圖2)是以C端為硫酯的多肽與N端為半胱氨酸(Cys)殘基的多肽反應得到以Cys為連接位點的多肽。由于連接所合成的多肽必須含Cys殘基,限制了該方法的應用。

　　化學區域選擇連接方法(圖3)是以2-巰芐基作為輔助基與硫酯反應。加快了縮合速度,輔助基易脫除,且去除輔助基連接是以苯胺的衍生物NA-(1-苯基-2-巰乙基)為輔助基團,對強酸保持穩定,使得N端多肽片段較易合成。

　　光敏感輔助基連接方法(圖4)是以NA-2-巰基-1-(2-硝基苯)乙基為輔助基(見光分解易脫除)多肽合成的。

　　施陶丁格連接方法(圖5)是以疊氮反應為基礎,以C端的膦硫酯和N端的疊氮化合物反應生成酰胺膦鹽,酰胺膦鹽水解得到多肽和膦氧化物。

　　正交化學連接方法是改進的施陶丁格連接方法,通過簡化膦硫酯輔助基來提高片段間的縮合率。1.4 組合化學法[20~25]

　　組合化學法是20世紀80年代在固相多肽合成的基礎上發展起來的。它將氨基酸的構建單元按某種組合方式連接起來,合成出包含大量化合物的化學庫,并從中篩選出具有某種物理、化學或藥理活性化合物的一套合成策略和篩選方案。與傳統合成方法不同的是,傳統合成方法一次只合成一種化合物,而組合化學法可同時合成多種化合物。常用的合成策略方法主要有:混合-均分法、迭代法、光控定位組合庫法、茶葉袋法[21]等。Dubs等[25]利用化學選擇平行方法,得到了含有102種兩親性黑色素細胞刺激素(R-MSH)的類似物的肽庫。經藥理測試發現,其中84種化合物的AMPs的誘導性高于已應用的R-MSH促效劑Melitane。

　　組合化學法能最大限度地篩選各種新化合物及其異構體,從而首先找到具有藥效作用的先導物,是世界各大醫藥公司普遍采用的方法。目前面臨的問題是:如何提高合成化合物組合庫的分子多樣性和開發與之配套的敏感有效的快速分析和鑒定手段。

　　1.5 酶解法[26,27]

　　用酶解法合成多肽,又稱酶法多肽,就是用生物酶降解蛋白質,將動植物大分子蛋白質降解成小分子活性多肽。酶解蛋白質所用的酶,大多數是肽酶類。近年來,人們運用酸、堿降解蛋白質獲得多肽收獲甚微,固定投資大,周期長,污染嚴重,風險大,未能實現工業化生產。武漢九生堂的鄒遠東教授利用酶解法開發出大豆多肽、大豆寡肽、鮑魚肽[26]、海參肽、苦瓜肽[27]、魚翅肽、燕窩肽等一系列多肽產品,在酶法多肽方面做出了杰出貢獻。酶法多肽具有以下優點:酶解不降低蛋白質的營養價值,可獲得比原食品蛋白質更多的功能;可保持多肽營養純天然綠色屬性,不含任何化學物質等。但酶解得到的是一系列多肽,分離純化難度較大,因此不適于合成單一的多肽。另外,肽酶的催化具有專一性,因此,尋找合適的肽酶也是該方法的一個難點。

　　1.6 基因工程法[28]

　　DNA重組技術的誕生為合成序列確定的多肽奠定了基礎,即可通過設計合適的DNA模板來控制多肽的序列。利用DNA重組技術,可以通過重組DNA產生的工程菌來大量高效地合成多種生物活性多肽。Urry等在大腸桿菌中表達了似彈性蛋白--聚纈氨酸-脯氨酸-甘氨酸-纈氨酸-甘氨酸肽(VPGVG),是基因工程技術應用于多肽合成的范例。利用基因工程技術生產的活性多肽還有肽類抗生素[28]、干擾素類、白介素類、生長因子類、腫瘤壞死因子、人生長激素、凝血因子、促紅細胞生成素、組織非蛋白纖溶酶原等。基因工程法合成多肽具有表達定向性強、產品安全衛生、原料來源廣泛和成本低等優點,可以得到質量高、療效好且具有天然活性的多肽類藥物,但存在高效表達等技術難題,分離困難,產率低,成本昂貴,難以用于規模生產。

　　1.7 發酵法[29]

　　發酵法是從培養的微生物產生的代謝產物中提取多肽的方法。目前,微生物能夠獨立合成的聚氨基酸只有E-聚賴氨酸(E-PL)、C-聚谷氨酸(C-PGA)和聚(L-精氨酸-L-天冬氨酸)(藍細菌肽)。發酵法的優點是工業化成本低,但是產物范圍窄,且產物提純復雜。

　　2 多肽的應用

　　目前,多肽的應用主要集中在多肽藥物、多肽藥物載體、組織工程材料和多肽營養食品等方面。

　　2.1 多肽藥物[30~35]

　　除了傳統的多肽類激素外,對多肽類藥物的開發已經發展到疾病防治的各個領域:多肽疫苗可用于SARS病毒[31]、肝炎、艾滋病等病毒性傳染病的預防;與腫瘤基因靶點特異結合的多肽可用于治療腫瘤[32~34];從肽庫內篩選細胞因子模擬肽;多個抗菌肽可殺死腫瘤細胞;天然植物中分離出的一些小肽可治療心血管疾病等。此外,在診斷試劑中多肽的用途主要是用作抗原檢測寄生蟲的抗體,多肽抗原比天然微生物或寄生蟲蛋白抗原的特異性強,也易于制備,且易于臨床應用。

　　2.2 多肽藥物載體[36,37]

　　多肽用作藥物載體,既可以用作藥物載體的修飾劑,也可以作為藥物載體的主要組成部分。Law等[36]設計了蛋白酶斷裂點連接的肽段在合適的溶劑中自組裝后將藥物包覆在微球內,遇到靶向蛋白酶使得斷裂點斷開,實現藥物的靶向釋放,如圖6所示。

　　彭師奇等將精氨酸-甘氨酸-天氨酸-絲氨酸(Arg-Gly-Asp-Ser,RGDS)四肽修飾脂質體用作藥物載體導向溶栓。運用血小板的纖維蛋白原(FG)受體配基RGDS肽作為導向歸巢裝置,偶聯于包裹尿激素UK的脂質體。載體與藥物之間以酸敏感性共價鍵的形式連接,在自然界或人體內能生物降解成內源性物質Glu,不易產生積蓄和毒副作用。

　　2.3 組織工程材料[38,39]

　　一些不具有生物活性的高分子多肽,如聚天冬氨酸、聚賴氨酸、聚谷氨酸等,由于具有良好的生物相容性、可控生物降解速率、可修飾性、設計的可塑性、結構的可控性等優點,逐漸成為組織工程中極具應用前景的一類新型材料。Langer等制備了聚(乳酸-賴氨酸),將RGD肽接枝到聚合物中賴氨酸的-NH2上,有效提高了聚合物表面的細胞粘附能力,克服了主鏈無活性基團的不足,獲得的組織工程支架材料既便于細胞識別,又能支持細胞生長[39]。

　　2.4 多肽營養食品[40]

　　活性肽類食品作為一種新型保健食品,具有獨到的特性和功能,在營養學上也有著許多優點,在食品工業中具有廣闊的應用前景。根據來源不同,活性肽營養食品主要有以下幾類:乳蛋白肽類制品、植物肽類制品、膠原肽類制品、畜產類和水產類多肽制品等。