新式高分辨率流式技術解構
內皮細胞微粒與冠狀動脈疾病的關系

關鍵詞：循環微粒（circulating microparticle, cMP），冠狀動脈疾病（Coronary Artery Disease,  CAD），循環微粒檢測

什么是循環微粒﹖

循環微粒（circulating microparticle, cMP）是細胞激活、損傷或凋亡后從細胞膜脫落的小囊泡。cMP的直徑約為0.1μm - 1μm，膜表面暴露著帶負電的磷脂酰絲氨酸（posphatidylserine, PS）以及細胞來源特異的膜表面抗原。這些特征將循環微粒區別于凋亡小體（apoptotic body）和外來體（exosome）， 凋亡小體是細胞凋亡時以出芽方式形成的，直徑大于1μm；而外來體來源于細胞內的多泡小體（multivesicular bodies），以外分泌的形式釋放出來，直徑大小為30nm - 100nm 。

根據微粒的來源，可以將微粒分為血小板微粒（platelet microparticles, PMPs）、紅細胞微粒（erythrocyte microparticles, Ery-MPs）、內皮細胞微粒（endothelial cell microparticles, EMPs）、粒細胞微粒（granulocyte microparticles, GMPs）及淋巴細胞微粒（lymphocyte-derived microparticles,  LMPs）等。研究證實，在健康人群中，PMPs在循環血液中所占的比例最大，其次是Ery-MPs。以往認為微粒只是單純的無活性的細胞碎片，但越來越多研究表明cMP在生理和病理情況下充當著重要的角色，尤其在抗凝、促炎、內皮損傷、血管收縮、誘導血管生長以及免疫調節等方面起重要作用，在糖尿病、心血管疾病、艾滋病、慢性炎癥疾病以及癌癥中都發現循環微粒水平的升高，對于它的認 識還在不斷地探索，其研究也越來越多。

循環微粒在冠狀動脈疾病中的研究

冠狀動脈疾病（Coronary Artery Disease, CAD）是心臟疾病的主要類型，也是導致心臟病發作的主要原因，它是由于粥樣斑塊在動脈內壁上的累積，導致動脈管腔變小，血流減少。CAD的發展非常緩慢，大多數病人可能幾十年都沒有明顯的癥狀，直到有一天突然心臟病發作。因此，對CAD的早期診斷可以大大降低病人心臟病發作的風險，傳統的診斷方法包括心電圖、量血壓、血管造影等，但這些方法都只能在比較晚期的時候起作用。研究發現，血管內皮細胞機能障礙是CAD發展過程中的一個重要因素，而內皮細胞微粒（EMPs）是判斷內皮細胞功能的一個新的生物標記物。實際上，許多研

循環微粒的檢測方法

目前cMP的檢測方法主要有激光共聚焦顯微鏡、掃描和透射電子顯微鏡、原子力顯微鏡、流式細胞儀和ELISA等，由于通量高、操作簡單，ELISA和流式細胞儀是比較常用的方法。ELISA方法容易受其他可溶性抗原的干擾，而且無法知道微粒的大小、數量等信息。流式細胞儀提供了更有效、快捷的微粒分析能力，現已有多種流式細胞標記物可用于微粒檢測，它們主要用于檢測微粒的活化狀態及其細胞來源。但傳統流式細胞儀的檢測極限通常是0.5μm，由于無法與背景噪音區分，直徑小于0.3μm-0.5μm的微粒難以檢測。

新式高分辨率流式細胞儀在檢測循環微粒的優勢

英國Apogee公司的A50高分辨率流式細胞儀突破傳統流式細胞儀的檢測極限，優化的光學模塊和優異的散射光檢測能力使得A50具有檢測小顆粒的最高靈敏度（100nm）和最好的光散射分辨率（10nm）。Fig.2展示的是Apogee與傳統流式細胞儀的技術對比，可以看到FC500和LSRII只能勉強區分0.5μm和0.6μm的微珠，0.5μm以下的微珠完全無法區分，而Apogee可以輕松地將0.2μm的微珠和0.4μm的微珠分成兩個群。由于檢測能力的限制，FC500和LSRII只能檢測到部分的0.2μm和0.4μm的微珠，對于0.2μm的微珠，LSRII和FC500的丟失率分別達到79%和96%；對于0.4μm的微珠，丟失率也分別達到12%和56% [2]。相反的，利用Apogee A50突出的高靈敏度和分辨率，可以清晰的將直徑相差10nm以上的微粒樣本進行分群、計數、分析。另外，多達9通道熒光檢測器，可以靈活使用cMP特定

粒的流式細胞儀，在循環微粒的檢測上優于傳統流式細胞儀。

Fig. 2. Size resolvability of different flow cytometers using polystyrene microspheres. Graphs show forward scatter relative intensity for 0.2 - 0.8μm polystyrene microspheres for three flow cytometers.

Apogee A50的應用展望

[1] Hu S-S, Zhang H-G, Zhang Q-J, Xiu R-J (2014) Small-Size Circulating Endothelial Microparticles in Coronary Artery Disease. PLoS ONE 9(8): e104528.
[2]Chandler WL, Yeung W, Tait JF. A new microparticle size calibration standard for use in measuring smaller microparticles using a new flow cytometer. J Thromb Haemost 2011; 9: 1216–24.