固相合成法制備抗原肽環肽
1.1 儀器與試劑
多肽合成儀(CS536，美國CSBio公司)，半制備型高效液相色譜儀(Waters Delta Prep4000，美國Waters公司)，分析型高效液相色譜儀(Agilent 1100，美國Agilent公司)，冷凍干燥機(Christ Alpha，德國Christ公司)，激光解吸電離飛行時間質譜儀(LCQ Deca，美國ThermoFinnigan公司)，紫外分光光度計(Beckman DU7400，美國Beckman公司)，C18反相分析柱(Sepax GPC18，5μm，120，4.6mm×150mm)。
實驗所用FmocProMerrifield Resin(取代值0.291mmol/g，交聯度1%，100～200目)、BocValWang Resin(取代值0.523mmol/g，交聯度1%，100～200目)、FmocProCTC Resin(取代值0.42mmol/g，交聯度1%，100～200目)、BocTyr(tBu)OH、BocProOH、BocIleOH、BocLeuOH、FmocTyr(tBu)OH、FmocProOH、FmocIleOH、FmocLeuOH、Bocstatine(3s，4s)OH、HATU［O(7偶氮苯并三氮唑1氧)N，N，N′，N′四甲基脲六氟磷酸酯］、HBTU(苯并三唑1四甲基六氟磷酸酯)、HOBt(N羥基苯并三唑)、BOP(鄰苯二甲酰丁辛酯)、DIEA(N，N二異丙基乙胺;二異丙基乙胺)、TFA(三氟乙酸)、DMF(二甲基甲酰胺)、DMSO(二甲亞砜)、DCM(二氯甲烷)、ACN(乙腈)、EDC［1乙基3(3二甲氨丙基)碳二亞胺鹽酸鹽］、NMM(N甲基嗎啉)和苯甲硫醚均由杭州中肽生化有限公司提供，哌啶經重蒸后使用，水為二次去離子水。
1.2 HS1及其類似物的化學合成
本文所合成的5種環肽序列分別為：
HS1：cyclo(Ile1Ile2Pro3Pro4Tyr5Val6Pro7
Leu8)；
A1HS1：cyclo(Ile1Ile2statine3Pro4Tyr5Val6
Pro7Leu8)；
A2HS1：cyclo(Ile1Ile2Pro3statine4Tyr5Val6
Pro7Leu8)；
A3HS1：cyclo(Ile1Ile2Pro3Pro4Tyr5Val6
statine7Leu8)；
A4HS1：cyclo(Ile1Ile2statine3statine4Tyr5
Val6Pro7Leu8)。
雖然這5種抗原肽環肽或環肽類似物的序列如上面所表示的非常相似，并且按照順序給每個氨基酸殘基做了編號，但考慮到每個化合物的疏水性和空間位阻可能并不完全相同，加之合成的線性肽鏈終究要環化成抗原肽環肽，因此，為了方便、有效地合成目的產物，我們選擇接肽反應的第一個氨基酸也不盡相同。
(1)HS1的合成路線與純化
樹脂溶脹 調用自編程序Method1，樹脂溶脹的具體方法是將FmocProCTC Resin 4.76g(合成規模為2.0mmol)用200ml DMF浸泡30min，使之充分溶脹，然后抽干。
脫除氨基保護基 調用自編程序Method2，具體方法為加入含20%哌啶的DMF溶液20ml，攪拌反應30min，再抽干。然后用DMF洗滌5次，以除去殘留的脫保護試劑。手工取樣，茚三酮檢測，若樹脂呈深藍色，則表明Fmoc保護基已經脫除。
接肽反應 調用自編程序Method3，具體方法是在反應器中加入溶解有3.33g FmocValOH的200ml DMF溶液，機械攪拌2min，然后加入HBTU 3.57g，最后加入NMM 2.02g［AA∶HBTU∶NMM(mol/mol)=3∶2.85∶6］，反應30min。抽干，用DMF洗滌3次，然后用甲醇洗滌樹脂，以除去氨基酸溶液和DMF，以便手工進行茚三酮檢測，檢測結果若樹脂呈現無色，則說明反應比較完全。依次調用程序Method2和Method3，按肽鏈的氨基酸序列依次用FmocTyr(2BrZ)OH、FmocProOH、FmocProOH等重復以上接肽反應，直至最終合成出所需肽鏈。合成順序為：Pro，Val，Tyr，Pro，Pro，Ile，Ile，L序為：Pro，Val，Tyr，Pro，Pro，Ile，Ileeu。
后續類似物的合成中，表1所列參數基本不變。BocstatineOH的投料比為2，接肽反應時間為40min，脫保護基時間為30min。
肽鏈的切割 將合成肽鏈用切割液［TFA∶TIS(triisopropylsilane)∶H2O=95.0∶2.5∶2.5］在低于20℃的條件下切割，反應時間為2.5h，然后減壓過濾，收集濾液，用冷乙醚沉淀溶解在切割液中的多肽，4000表1 HS1合成中各氨基酸投料比、接肽反應時間r/min離心3min，真空干燥12h，得線性肽鏈的粗品約1.5g。
抗原肽肽鏈的環化 將線性多肽粗品1.4g用200ml DMF溶解，依次加入EDC(2eq，0.6g)、BOP(1eq，0.7g)、HOBt(2eq，0.42g)和DIEA(5eq，1.1g)，過夜環化。加入EDC可以加速縮合反應。蒸干DMF，得環肽粗品1.35g，粗品用MALDITOF質譜儀進行分析鑒定。
環肽粗品的純化 將上述環化粗品肽溶于適量DMSO中(由于此肽的水溶性不好，上樣濃度要嚴格控制在小于1mg/ml)，上樣樣品用5μm的濾紙過濾。制備色譜柱為Waters XBridge C18、5μm反相柱；洗脫液：A液為0.1% TFA的水溶液，B液為含0.1% TFA的乙腈水溶液；檢測波長220nm。采用60min內B液由30%～65%的線性梯度洗脫方式，流速為38ml/min。收集純度高于95%的餾分。最后冷凍干燥，得100mg純度大于90%的最終產品。
分析型HPLC檢測純度 色譜柱為SepaxGPC18反相柱(4.6mm×150mm，5μm，120)；洗脫液：A液為0.1% TFA的水溶液，B液為含0.1% TFA的乙腈水溶液；檢測波長220nm。采用20min內B液由60%～80%的線性梯度洗脫方式，流速為1.0ml/min。
MS鑒定 激光解吸電離飛行時間質譜儀檢測目標產物的分子量。
(2)A1HS1的合成路線與純化 與HS1的合成略有不同，在A1HS1的合成中，合成方法主要有以下幾點變化：①樹脂改為FmocProMerrifield Resin；②氨基酸為Boc保護；③每連接一個氨基酸殘基，要用50% TFA/DCM將肽鏈切割下來，然后脫保護、洗滌、活化樹脂，再連下一個氨基酸殘基，最后從樹脂上將肽鏈切割下來的切割液為HF，時間1.2h；④純化時梯度洗脫條件為B液：70%～100%；⑤HPLC分析時B液：61%～81%；⑥合成順序為：Pro，Val，Tyr，Pro，statine，Ile，Ile，Leu。其余同HS1合成。冷凍干燥后得250mg純度大于93%的最終產品。由于溶解度比HS1好，故收率較高。
(3)A2HS1的合成路線與純化 類似于A1HS1的合成，同HS1的合成相比較，在A2HS1合成中：①樹脂為FmocProCTC Resin；②氨基酸為Fmoc保護；③最后切割液為F液，時間2.5h；④純化時梯度洗脫條件為B液：65%～90%；⑤HPLC分析時B液：60%～80%；⑥合成順序為：Pro，Ile，Ile，Leu，Pro，Val，Tyr，statine；⑦因statine是用Boc保護，因此在連接statine后，要將肽鏈片段先從樹脂上切割下來，然后脫保護、洗滌、樹脂活化，再連下一個殘基。其余同HS1合成。冷凍干燥后得268mg純度大于92%的最終產品。由于溶解度比HS1好，故收率較高。
(4)A3HS1的合成路線與純化 類似于A1HS1的合成，同HS1的合成相比較，在A3HS1合成中：①樹脂為FmocValWang Resin；②氨基酸為Fmoc保護；③切割液為F液，時間2.5h；④純化時梯度洗脫條件為B液：43%～85%；⑤HPLC分析時B液：50%～70%；⑥合成順序為：Val，Tyr，Pro，Pro，Ile，Ile，Leu，statine；⑦因statine是用Boc保護，因此在連接statine后，要將肽鏈片段先從樹脂上切割下來，然后脫保護、洗滌、樹脂活化，再連下一個殘基。其余同HS1合成。冷凍干燥后得245mg純度大于98%的最終產品。由于溶解度比HS1好，故收率較高。
(5)A4HS1的合成路線與純化 類似于A1HS1的合成，同HS1的合成相比較，在A4HS1合成中：①樹脂為FmocProMerrifield Resin；②氨基酸為Boc保護；③每連接一個氨基酸殘基，要用50% TFA/DCM切割，然后洗滌，再連下一個氨基酸殘基，最后從樹脂上將肽鏈切割下來，切割液為HF，時間1.2h；④純化時梯度洗脫條件為B液：62%～80%；⑤HPLC分析時B液：62%～82%；⑥合成順序為：Pro，Val，Tyr，statine，statine，Ile，Ile，Leu；⑦因statine是用Boc保護，因此在連接statine后，要將肽鏈片段先從樹脂上切割下來，然后脫保護、洗滌、樹脂活化，再連下一個殘基。其余同HS1合成。冷凍干燥后得215mg純度大于90%的最終產品。由于溶解度比HS1好，故收率較高
多肽合成儀(CS536，美國CSBio公司)，半制備型高效液相色譜儀(Waters Delta Prep4000，美國Waters公司)，分析型高效液相色譜儀(Agilent 1100，美國Agilent公司)，冷凍干燥機(Christ Alpha，德國Christ公司)，激光解吸電離飛行時間質譜儀(LCQ Deca，美國ThermoFinnigan公司)，紫外分光光度計(Beckman DU7400，美國Beckman公司)，C18反相分析柱(Sepax GPC18，5μm，120，4.6mm×150mm)。
實驗所用FmocProMerrifield Resin(取代值0.291mmol/g，交聯度1%，100～200目)、BocValWang Resin(取代值0.523mmol/g，交聯度1%，100～200目)、FmocProCTC Resin(取代值0.42mmol/g，交聯度1%，100～200目)、BocTyr(tBu)OH、BocProOH、BocIleOH、BocLeuOH、FmocTyr(tBu)OH、FmocProOH、FmocIleOH、FmocLeuOH、Bocstatine(3s，4s)OH、HATU［O(7偶氮苯并三氮唑1氧)N，N，N′，N′四甲基脲六氟磷酸酯］、HBTU(苯并三唑1四甲基六氟磷酸酯)、HOBt(N羥基苯并三唑)、BOP(鄰苯二甲酰丁辛酯)、DIEA(N，N二異丙基乙胺;二異丙基乙胺)、TFA(三氟乙酸)、DMF(二甲基甲酰胺)、DMSO(二甲亞砜)、DCM(二氯甲烷)、ACN(乙腈)、EDC［1乙基3(3二甲氨丙基)碳二亞胺鹽酸鹽］、NMM(N甲基嗎啉)和苯甲硫醚均由杭州中肽生化有限公司提供，哌啶經重蒸后使用，水為二次去離子水。
1.2 HS1及其類似物的化學合成
本文所合成的5種環肽序列分別為：
HS1：cyclo(Ile1Ile2Pro3Pro4Tyr5Val6Pro7
Leu8)；
A1HS1：cyclo(Ile1Ile2statine3Pro4Tyr5Val6
Pro7Leu8)；
A2HS1：cyclo(Ile1Ile2Pro3statine4Tyr5Val6
Pro7Leu8)；
A3HS1：cyclo(Ile1Ile2Pro3Pro4Tyr5Val6
statine7Leu8)；
A4HS1：cyclo(Ile1Ile2statine3statine4Tyr5
Val6Pro7Leu8)。
雖然這5種抗原肽環肽或環肽類似物的序列如上面所表示的非常相似，并且按照順序給每個氨基酸殘基做了編號，但考慮到每個化合物的疏水性和空間位阻可能并不完全相同，加之合成的線性肽鏈終究要環化成抗原肽環肽，因此，為了方便、有效地合成目的產物，我們選擇接肽反應的第一個氨基酸也不盡相同。
(1)HS1的合成路線與純化
樹脂溶脹 調用自編程序Method1，樹脂溶脹的具體方法是將FmocProCTC Resin 4.76g(合成規模為2.0mmol)用200ml DMF浸泡30min，使之充分溶脹，然后抽干。
脫除氨基保護基 調用自編程序Method2，具體方法為加入含20%哌啶的DMF溶液20ml，攪拌反應30min，再抽干。然后用DMF洗滌5次，以除去殘留的脫保護試劑。手工取樣，茚三酮檢測，若樹脂呈深藍色，則表明Fmoc保護基已經脫除。
接肽反應 調用自編程序Method3，具體方法是在反應器中加入溶解有3.33g FmocValOH的200ml DMF溶液，機械攪拌2min，然后加入HBTU 3.57g，最后加入NMM 2.02g［AA∶HBTU∶NMM(mol/mol)=3∶2.85∶6］，反應30min。抽干，用DMF洗滌3次，然后用甲醇洗滌樹脂，以除去氨基酸溶液和DMF，以便手工進行茚三酮檢測，檢測結果若樹脂呈現無色，則說明反應比較完全。依次調用程序Method2和Method3，按肽鏈的氨基酸序列依次用FmocTyr(2BrZ)OH、FmocProOH、FmocProOH等重復以上接肽反應，直至最終合成出所需肽鏈。合成順序為：Pro，Val，Tyr，Pro，Pro，Ile，Ile，L序為：Pro，Val，Tyr，Pro，Pro，Ile，Ileeu。
后續類似物的合成中，表1所列參數基本不變。BocstatineOH的投料比為2，接肽反應時間為40min，脫保護基時間為30min。
肽鏈的切割 將合成肽鏈用切割液［TFA∶TIS(triisopropylsilane)∶H2O=95.0∶2.5∶2.5］在低于20℃的條件下切割，反應時間為2.5h，然后減壓過濾，收集濾液，用冷乙醚沉淀溶解在切割液中的多肽，4000表1 HS1合成中各氨基酸投料比、接肽反應時間r/min離心3min，真空干燥12h，得線性肽鏈的粗品約1.5g。
抗原肽肽鏈的環化 將線性多肽粗品1.4g用200ml DMF溶解，依次加入EDC(2eq，0.6g)、BOP(1eq，0.7g)、HOBt(2eq，0.42g)和DIEA(5eq，1.1g)，過夜環化。加入EDC可以加速縮合反應。蒸干DMF，得環肽粗品1.35g，粗品用MALDITOF質譜儀進行分析鑒定。
環肽粗品的純化 將上述環化粗品肽溶于適量DMSO中(由于此肽的水溶性不好，上樣濃度要嚴格控制在小于1mg/ml)，上樣樣品用5μm的濾紙過濾。制備色譜柱為Waters XBridge C18、5μm反相柱；洗脫液：A液為0.1% TFA的水溶液，B液為含0.1% TFA的乙腈水溶液；檢測波長220nm。采用60min內B液由30%～65%的線性梯度洗脫方式，流速為38ml/min。收集純度高于95%的餾分。最后冷凍干燥，得100mg純度大于90%的最終產品。
分析型HPLC檢測純度 色譜柱為SepaxGPC18反相柱(4.6mm×150mm，5μm，120)；洗脫液：A液為0.1% TFA的水溶液，B液為含0.1% TFA的乙腈水溶液；檢測波長220nm。采用20min內B液由60%～80%的線性梯度洗脫方式，流速為1.0ml/min。
MS鑒定 激光解吸電離飛行時間質譜儀檢測目標產物的分子量。
(2)A1HS1的合成路線與純化 與HS1的合成略有不同，在A1HS1的合成中，合成方法主要有以下幾點變化：①樹脂改為FmocProMerrifield Resin；②氨基酸為Boc保護；③每連接一個氨基酸殘基，要用50% TFA/DCM將肽鏈切割下來，然后脫保護、洗滌、活化樹脂，再連下一個氨基酸殘基，最后從樹脂上將肽鏈切割下來的切割液為HF，時間1.2h；④純化時梯度洗脫條件為B液：70%～100%；⑤HPLC分析時B液：61%～81%；⑥合成順序為：Pro，Val，Tyr，Pro，statine，Ile，Ile，Leu。其余同HS1合成。冷凍干燥后得250mg純度大于93%的最終產品。由于溶解度比HS1好，故收率較高。
(3)A2HS1的合成路線與純化 類似于A1HS1的合成，同HS1的合成相比較，在A2HS1合成中：①樹脂為FmocProCTC Resin；②氨基酸為Fmoc保護；③最后切割液為F液，時間2.5h；④純化時梯度洗脫條件為B液：65%～90%；⑤HPLC分析時B液：60%～80%；⑥合成順序為：Pro，Ile，Ile，Leu，Pro，Val，Tyr，statine；⑦因statine是用Boc保護，因此在連接statine后，要將肽鏈片段先從樹脂上切割下來，然后脫保護、洗滌、樹脂活化，再連下一個殘基。其余同HS1合成。冷凍干燥后得268mg純度大于92%的最終產品。由于溶解度比HS1好，故收率較高。
(4)A3HS1的合成路線與純化 類似于A1HS1的合成，同HS1的合成相比較，在A3HS1合成中：①樹脂為FmocValWang Resin；②氨基酸為Fmoc保護；③切割液為F液，時間2.5h；④純化時梯度洗脫條件為B液：43%～85%；⑤HPLC分析時B液：50%～70%；⑥合成順序為：Val，Tyr，Pro，Pro，Ile，Ile，Leu，statine；⑦因statine是用Boc保護，因此在連接statine后，要將肽鏈片段先從樹脂上切割下來，然后脫保護、洗滌、樹脂活化，再連下一個殘基。其余同HS1合成。冷凍干燥后得245mg純度大于98%的最終產品。由于溶解度比HS1好，故收率較高。
(5)A4HS1的合成路線與純化 類似于A1HS1的合成，同HS1的合成相比較，在A4HS1合成中：①樹脂為FmocProMerrifield Resin；②氨基酸為Boc保護；③每連接一個氨基酸殘基，要用50% TFA/DCM切割，然后洗滌，再連下一個氨基酸殘基，最后從樹脂上將肽鏈切割下來，切割液為HF，時間1.2h；④純化時梯度洗脫條件為B液：62%～80%；⑤HPLC分析時B液：62%～82%；⑥合成順序為：Pro，Val，Tyr，statine，statine，Ile，Ile，Leu；⑦因statine是用Boc保護，因此在連接statine后，要將肽鏈片段先從樹脂上切割下來，然后脫保護、洗滌、樹脂活化，再連下一個殘基。其余同HS1合成。冷凍干燥后得215mg純度大于90%的最終產品。由于溶解度比HS1好，故收率較高
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抗原肽
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