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人PBMC調節T細胞檢測操作步驟

瀏覽次數:1535 發布日期:2014-12-6  來源:本站 僅供參考,謝絕轉載,否則責任自負

1、制備PBMC,并調整細胞濃度至107/ml。

2、在每個流式上樣管中加入100 µl準備好的細胞懸液,細胞數約為1x106個。

3、按照細胞表面抗原染色方法標記CD4和CD25。根據說明書和抗體管上的標識確定抗體用量(一般來說是20ul,可能隨批次有差異)。按個人要求設置空白管、對照管、補償管和樣本管。4 ℃孵育30 分鐘。 

4、用預冷PBS溶液洗滌細胞,300 -400 g離心5分鐘,去上清。

5、用3倍體積的固定/破膜稀釋液 稀釋 固定/破膜濃縮液,制成固定/破膜工作液,注意要新鮮配制,每個樣本的用量為1ml。

6、旋渦震蕩重懸細胞后加入1ml的固定/破膜工作液(Fixation/Permeabilization)(1:3稀釋好),并再次旋渦混勻。

7、避光4℃孵育30分鐘到60分鐘。

8、將破膜緩沖液用去離子水1:9稀釋,制成工作液。每個樣本的用量為4~5ml。

9、無需洗滌,直接加入2ml 破膜緩沖液(Permeabilization Buffer)300 -400 g離心洗滌細胞并棄去上清液。

10、(可選)重復第9步操作洗滌細胞。

11、加入100 ul PBS重懸細胞。

12、(封閉可選)體系中加入2%的大鼠血清2 ul,室溫避光孵育30分鐘。

13、體系加入適量的Foxp3抗體,對照管中加入適量的同型對照,具體用量參照說明書,避光4℃孵育至少30分鐘。建議進行預實驗摸索出抗體的最適濃度。

14、加入2ml破膜工作液離心洗滌細胞并棄去上清液。

15、重復上一步洗滌細胞。

16、用適量體積的Flow Cytometry Staining Buffer重懸細胞,并上機檢測并分析。注:由于染色過程中使用了細胞固定和破膜,對比起活細胞在形態上會有一定變化,因此FSC/SSC圖中圈門時需要做一定調整。                 

注:以上說明書僅供參考,具體實驗請對照廠商說明書操作。

閱讀原文:http://www.liankebio.com/TechServiceShow/articleID/2014120006.html

發布者:杭州聯科生物技術股份有限公司
聯系電話:4006721600
E-mail:network@liankebio.com

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