水環境污染生物監測——生物測試法
水環境污染生物監測——生物測試法
利用生物受到污染物危害或毒害后所產生的反應或生理機能的變化來評價水體污染狀況，確定毒物安全濃度的方法稱為生物測試法。該方法有靜水式生物測試和流水式生物測試兩種。前者是把受試生物放于不流動的試驗溶液中，測定污染物的濃度與生物中毒反應之間的關系，從而確定污染物的毒性；后者把受試生物放于連續或間歇流動的試驗溶液中，測定污染物濃度與生物反應之間的關系。測試分為短期(不超過96h)的急性毒性試驗和長期(如數月或數年)的慢性毒性試驗。在一個試驗裝置內，測試生物可以是一種，也可以是多種。測試工作可在實驗室內進行，也可在野外污染水體中進行。
1、水生生物毒性試驗
進行水生生物毒性試驗可用魚類、溞類、藻類等，其中魚類毒性試驗應用較廣泛。
魚類對水環境的變化反應十分靈敏，當水體中的污染物達到一定濃度或強度時，就會引起系列中毒反應。例如：行為異常、生理功能紊亂、組織細胞病變，直至死亡。魚類毒性試驗的主要目的是尋找某種毒物或工業廢水對魚類的半數致死濃度與安全濃度，為制定水質標準和廢水排放標準提供科學依據；測試水體的污染程度和檢查廢水處理效果等。有時魚類毒性試驗也用于一些特殊目的，如比較不同化學物質毒性的高低，測試不同種類魚對毒物的相對敏感性，測試環境因素對廢水毒性的影響等。下面介紹靜水式魚類急性毒性試驗。
（1）供試驗魚的選擇和馴養。
金魚來源方便，常用于試驗。要選擇無病、活潑、魚鰭完整舒展、食欲和逆水性強、體長(不包括尾部)約3cm的同種和同齡的金魚。選出的魚必須先在與試驗條件相似的生活條件(溫度、水質等)下馴養7d以上；試驗前一天停止喂食；如果在試驗前四天內發生死亡現象或發病的魚高于10％，則不能使用。
（2）試驗條件選擇。
每種濃度的試驗溶液為一組，每組至少10條魚。試驗容器用容積約10L的玻璃缸，保證每升水中魚質量不超過2g。
試驗溶液的溫度要適宜，對冷水魚為12~28℃，對溫水魚為20～28℃。同一試驗中，溫度變化為±2℃；試驗溶液中不能含大量耗氧物質，要有足夠的溶解氧，對冷水魚DO≥5mg／L，對溫水魚DO≥4mg／L；試驗溶液的pH應為6.7～8.5，試驗期間pH波動范圍不得超過0.4個pH單位；硬度影響毒物毒性，一般來說，硬水可降低毒物毒性，而軟水可增強毒物毒性，因此，必須注意檢測試驗溶液的硬度，并在報告中注明。硬度應為50～250mg／L(以CaCO3計)。
配制試驗溶液和馴養魚用的水應是未受污染的河水或湖水。如果使用自來水，必須經充分曝氣才能使用。不宜使用蒸餾水。
（3）試驗步驟。
①預試驗(探索性試驗)：為保證正式試驗順利進行，須經探索性試驗確定試驗溶液的濃度范圍，即通過觀察24h(或48h)魚類中毒的反應和死亡情況，找出不發生死亡、全部死亡和部分死亡的濃度。
②試驗溶液濃度設計：合理設計試驗溶液濃度，是試驗成功的重要保證，通常選7個濃度(至少5個)，濃度間隔取等對數間距，例如：10.0、5.6、3.2、1.8、1.0(對數間距0.25)或10.0、7.9、6.3、5.0、4.0、3.6、2.5、2.0、1.6、1.26、1.0(對數間距0.1)，其單位可用體積分數(如廢水)或質量濃度(mg／L)表示。另設一對照組，對照組在試驗期間魚死亡率超過10％，則整個試驗結果不能采用。
③試驗：將試驗用魚分別放人盛有不同濃度溶液和對照水的玻璃缸中，并記錄時間。前8h要連續觀察和記錄試驗情況，如果正常，繼續觀察，記錄24h、48h和96h魚的中毒癥狀和死亡情況，供判定毒物或工業廢水的毒性。
④毒性判定：半數致死量(LD50)或半數致死濃度(LC50)是評價毒物毒性的主要指標之一。
求LC50的簡便方法是將試驗用魚死亡半數以上和半數以下的數據與相應試驗溶液毒物(或廢水)濃度繪于半對數坐標紙上(對數坐標表示毒物濃度，算術坐標表示死亡率)，用直線內插法求出。將三種試驗時間試驗魚死亡半數以上和半數以下最接近半數的死亡率數值與相應廢水濃度數值的坐標交點標出，并分別連接起來，再由50％死亡率處引一橫坐標的垂線，與上述三線相交，由三交點分別向縱坐標作垂線，垂線與縱坐標的交點處濃度即為LC50，可見24h、48h和96h的LC50分別為5.2％、4.7％、4.4％。
⑤魚類毒性試驗的應用：魚類毒性試驗的一個重要目的是根據試驗數據估算毒物的安全濃度，為制定有毒物質在水中的最高允許濃度提供依據。
目前應用比較普遍的是最后一種。對易分解、積累少的化學物質一般選用的系數為0.05～0.1，對穩定的、能在魚體內高積累的化學物質，一般選用的系數為0.01～0.05。
按公式計算出安全濃度后，要進一步做驗證試驗，特別是具有揮發性和不穩定性的毒物或廢水，應當用恒流裝置進行長時間(如一個月或幾個月)的驗證試驗，并設對照組進行比較，如發現有中毒癥狀，則應降低毒物或廢水濃度再進行試驗，直到確認某濃度對魚是安全的，即可定為安全濃度。此外，在驗證試驗過程中必須投喂餌料。
2、發光細菌法
（1）方法原理
發光細菌是一類非致病的革蘭氏陰性微生物，它們在適當的條件下能發射出肉眼可見的藍綠色光（450~490nm）。當樣品毒性組分與發光細菌接觸時，可影響或干擾細菌的新陳代謝，使細菌的發光強度下降或不發光。在一定毒物濃度范圍內，有毒物質濃度與發光強度成負相關線性關系，因而可使用生物發光光度計測定水樣的相對發光強度來監測有毒物質的濃度。
國家標準（GB/T 15441——1995）中，以氯化汞作為參比毒性表征廢水或可溶性化學物質的毒性，也可用半數有效濃度（EC50），即發光強度為最大發光強度一半時的廢水濃度或可溶性化學物質的濃度來表征；選用明亮發光桿菌T3亞種作為發光細菌。因該菌是一種海洋細菌，故水樣和參比毒物溶液應含有一定濃度的氯化鈉。
目前，常采用新鮮發光細菌培養法和冷凍干燥發光菌粉制劑法。
（2）測定要點
①試驗材料的準備：專用生物毒性測試儀，發光細菌瓊脂培養液，液體培養基，0.02~0.24mg/L系列HgCl2標準溶液，新鮮明亮發光桿菌T3亞種或明亮發光桿菌凍干粉，化學毒物或綜合廢水等。
②新鮮發光細菌懸液的制備：從明亮發光桿菌的菌種斜管面中挑取一環細菌接種于新的發光細菌瓊脂斜面上，待斜面長滿菌苔并明顯發光時加入適量稀釋液并制成菌懸液；取0.1mL菌懸液接種于50mL液體培養基中，在22℃搖床震蕩培養至對數生長中期（12~14h），用稀釋液將菌懸液稀釋成5×107個（細胞）/[mL（菌懸液）]，置于4℃下保存備用。
③樣品測定：將過濾去除顆粒物雜質的待測水樣加入占水樣質量3％的NaCl，依次加入稀釋液和待測水樣，恒溫（20±0.5）℃后加入等量發光細菌懸液，依次測其發光強度。
④測試結果分析：根據測得的待測水樣的發光強度計算其相對折光率。
3、致突變和致癌物檢測
致突變和致癌物也稱誘變劑，其檢測方法有微核測定法、艾姆斯(Ames)試驗法、染色體畸變試驗法等。
微核測定法原理基于：生物細胞中的染色體在復制過程中常會發生一些斷裂，在正常情況下，這些斷裂絕大多數能自行愈合，但如果受到外界誘變劑的作用，就會產生一些游離染色體斷片，形成包膜，變成大小不等的小球體(微核)，其數量與外界誘變劑強度成正比，可用于評價環境污染水平和對生物的危害程度。該方法所用生物材料可以是植物或動物組織或細胞。植物廣泛應用紫露草和蠶豆根尖。紫露草以其花粉母細胞在減數分裂過程中的染色體作為誘變劑的攻擊目標，把四分體中形成的微核數作為染色體受到損傷的指標，評價受危害程度。蠶豆根尖細胞的染色體大，DNA含量多，對誘變劑反應敏感。
Ames試驗是利用鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)的組氨酸營養缺陷型菌株發生回復突變的性能來檢測被檢物是否具有致突變性。這種菌株均含有控制組氨酸合成的基因，在不含組氨酸的培養基中不能生長，但如果存在致突變物時，便作用于菌株的DNA，使其特定部位發生基因突變而回復為野生型菌株，能在無組氨酸的培養基中生長�？紤]到許多物質是在體內經代謝活化后才顯示出致突變性的，Ames等人采用了在體外加入哺乳動物肝微粒體酶系統(簡稱s一9混合液)使被檢物活化的方法，提高了試驗的可靠性。
色體畸變試驗是依據生物細胞在誘變劑的作用下，其染色體數目和結構發生變化，如染色單體斷裂、染色單體互換等，以此檢測誘變劑及其強度。
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