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濾光片在共聚焦顯微鏡上的應用

瀏覽次數:9099 發布日期:2014-5-15  來源:本站 僅供參考,謝絕轉載,否則責任自負

由于對孔徑的獨特的布置,共聚焦顯微鏡探測器所提供的圖像對應于一個薄的光學切片或是樣品的截面。例如,一個幾毫米厚的樣品在焦平面處沿z軸降至少于微米。

共聚焦處的光照場通過一個被稱為針孔的孔徑所限制。視場同樣也受到一個針孔的限制,針孔的位置是相對于第一個孔徑與照射點共軛的像平面上。這種共聚焦配置的結果就是降低了對散焦光的探測,從而通過減少成像容積來增加信噪比。

Marvin Minsky首先設計了共聚焦顯微鏡并在1957年的一份專利中描述了一個通過移動照射光束平臺來實現的。從樣品發來的調制光被送往光電管用示波器觀察。光照射及隨后的探測是通逐點地過移動平臺來實現的。Minsky的極具原創性的構想最終徹底改變了顯微鏡。

Minsky的專利被通過的時候,還是存在有幾個技術難點。由于限制孔徑,他的系統需要非常強的光源。鑒于由針孔損失的光強,在當時激光并不存在,并且也沒有其他足夠強的光源來激發熒光。在那時候Minsky使用的是長期持久的示波器做觀測,因此沒有辦法如實記錄圖像。導致其他發明者對這一特殊的顯微鏡做進一步的發展成為對普通研究者的有效工具。

發展強烈的單色光源—激光—解決了照射的問題。計算機裝備了數字化儀之后,使記錄和現實圖像變得輕而易舉。如今,現在掃描共焦使用激光或結合激光作為照射光源。這種掃描是通過精確控制振鏡以光柵運動的方式,用最小光斑掃過視場,就像通過電腦控制電視一樣。從樣品散射或反射的熒光信號被發送到光電倍增管(PMT),這是一次形成圖像在屏幕上的一個點(像元素、像素點)。

雖然Minsky羅列了共聚焦的許多優點,或許最重要的功能就是掃描共聚焦顯微鏡能夠對樣品進行光學截面成像。傳統上,通過固定組織然后仔細地將其切片成以便觀察和成像的薄層,來獲取細胞或組織的精細結構。這個過程需要將樣品處死,并且需要研究人員花費好幾年時間去學習切片技術才能將樣品切割到成像所需的足夠薄的厚度。

共聚焦的光學切片性能允許用戶對厚組織成像而不需要特殊的切片技巧。它還允許用戶對活的細胞、組織以及生物體進行超高分辨率成像。活體細胞成像已經成為共焦顯微鏡的一個重要組成部分。

這種光學切片的能力也意味著單張切片/圖像可以保存到計算機,然后還可以將圖片重組為樣品的三維圖像。這在現有的激光掃描系統中是非常重要的特征。

此系統在熒光成像中會采用一些特殊的光學元件。一個常見的誤解認為激光器產生的激光輸出只有一個波長。實際上幾乎所有的激光器都將產生諧波或散射其他波長光。雖然這些次波段的光跟主波段相比強度很弱,但是他們還是可以大大降低信噪比。如果熒光的發射波段正好落在激光諧波的范圍內(或是來自激光的其他雜光),那么熒光信號可能會完全被掩蓋掉而探測不到。

光路中的首要器件就是激光純化濾波片,這就是經修飾過的激發光濾波片。由于激光的相干性和相對較小的光束以及光路準直的要求,這些鏡片都是要經過研磨和拋光處理的。這就與寬場顯微鏡形成鮮明的對比,因為寬場顯微鏡不需要研磨和拋光。純化鏡片還應具有很好的傳輸特性,包括波前畸變要少于每英寸一個波長。偏離角(與鏡片外緣理想平行線的偏差)應盡量減小到小于一個弧度角分,這樣在同一個系統中使用不同純化濾波片的時候就不必重新矯正了。

一個純化濾波片的半波寬度(FWHM)通常是在10nm左右。它會阻塞激光光源的其他雜光(最大范圍會從紫外光到1200nm)和減反射涂層來達到最大傳輸。

隨著更新、更強的激光器的出現,利用增透膜來增加透過率就顯得沒有必要了。然而,這些光學器件采用最大反射的干涉涂層以避免熱損傷,增透膜將因此減少表面反射。這些反射光不能被反射進入激光器的共振腔。因此,這些光件被設計用于入射角(AOI)在3.5度到5度之間。二極管激光器在熱身之后所發射的光的波長會有輕微的變化,因此,我們建議為這些光源配備20-25nm寬的純化濾波片。在共聚焦系統和普通熒光顯微系統中,為了獲得較好的平面平整度,它們必須克服波前像差。雖然兩種系統的波前像差都控制在每英寸一個波的范圍內,但在共聚焦系統中選擇二向色鏡顯然可以獲得更好的效果。

目前,要4-6m厚的熔融石英基片上實現二向色性已經很常見了,但越來越多的需求需要用更厚的基片來消除波前像差并實現二向色性。

在過去幾年時間里,隨著激光器的規模做得越來越大,也會有這些越來越大的功率負載可能會摧毀主鏡方面的擔心。這對于設計良好的二向色鏡來說不成問題,對常見大小的光束負載至少達到8-10瓦特的功率。通過增透膜來最大限度的減小聚束光的反射使透射率最大化。

偏振也是濾鏡要考慮的另一個因素。因為所有的光件對光路有偏轉角度時都可以充當偏振鏡,這對大多數偏振激光來說就顯得尤為重要。

所有熒光發射濾鏡的主要作用就是阻止激發光的透過。相比較于熒光顯微鏡而言,對于共聚焦系統,這種阻塞并不包含很寬的光譜范圍。然而,由于激光束的高功率輸出,需要對激光發射的特定波長專門設計更大的阻塞(或許高于OD 8)。

對共聚焦系統發射濾鏡的實際設計還是存在一些爭議。由于大多數探測器采用光電倍增管(PMT),圖像一次采集只形成一個像素(圖像元素),這些濾鏡光件就不需要打磨和拋光。但由于共聚焦成像對分辨率的要求越來越高,就像其他發射濾波片一樣經過打磨和拋光并不是在浪費精力。近期一些證據表明,發射濾波片具有較大楔形時(光束變差)可能會造成形態學測量的不準確,這種不準確在長發射光路中可能會更嚴重。

激光系統的濾波片光具座是圍繞激光發射而設計的,并不一定針對特定熒光染料的最大或激發。這確實帶來有關的幾個問題,什么樣的熒光染料才適合特定的激光系統。幸運的是,現在從熒光染料的供應商那里可以獲得更多的選擇了。另外也可以選擇使用可以方便和快速反射多個激光束的多色主鏡。

發布者:美國科洛瑪技術公司廈門代表處
聯系電話:0592-5062089
E-mail:china@chroma.com

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