在讀板機上進行基于時間分辨熒光標記的Western Blot蛋白檢測和定量

Vanitha Thulasiraman1, Jia-Ren Lin2, Cathy Olsen1, Rainer Muehlbacher3, Brian Quast1,
Michael Katzlinger3, Josef Atzler3, Karlene A. Cimprich2, Evan F. Cromwell1                1Molecular Devices LLC, Sunnyvale, California, USA; 2Department of Chemical & Systems Biology,Stanford University, Stanford, California, USA; 3Molecular Devices GmbH, Salzburg, Austria

摘要

蛋白檢測在制藥和臨床研究領域是一項非常重要的項目，而Western Blot(WB)檢測則是眾多蛋白檢測方法中最常見的一種。目前，檢測轉印到WB膜上蛋白的技術眾多，包括熒光標記、銀染和化學發光法等。可是，每一種技術都有其局限，人們一直致力于尋找提高WBs定量準確度和動態檢測范圍的技術方法。這里，介紹一種最新的在SpectraMax i3或Paradigm多功能酶標儀上檢測WBs膜的蛋白分析方法。膜上使用銪元素-螯合物或鏈霉素標
記二抗特異結合被研究的蛋白。銪元素標記具有長熒光壽命周期，可至1ms級別，所以熒光的檢測采用時間分辨的模式，從而可以減少來自于自發熒光和其他短壽命周期的雜光的背景。WBs膜被置于酶標儀內，然后使用TRF卡盒進行WBs膜優化掃描。此方法不涉及酶的檢測，加之銪元素-螯合物標記物具有很強的光漂白抗性，因而信號十分穩定能至幾周到幾個月，這就允許對膜進行重復掃描以及可能進行不同條帶的強度對比以及根據標品進行更精確的定量。TRF檢測方式采用單光子計數模式，所以理論的動態檢測范圍為>105。實際應用中，動態檢測范圍則受限于高含量條帶的熒光飽和以及非特異性結合造成的背景因素。由于不使用CCD不會出現高光溢出現象，而這卻是化學發光和普通熒光檢測的常見問題，所以此方法能夠提供非常銳利的條帶和出色的圖像質量。這一新穎的多功能酶標儀檢測平臺上的Sc a n l a t e r  Western Blot檢測系統以其操作簡便、檢測靈敏和信號的超高穩
定性，提供了出色的WBs檢測性能表現，必將給多功能酶標儀在實驗室應用方面帶來又一重大突破！

原理

ScanLater Western Blot檢測系統簡化了Western Blot的流程，二抗使用銪元素-螯合物標記物，掃描在酶標儀上進行。不需要底物，膜洗滌后直接進行掃描檢測。銪元素具有長熒光壽命周期，至1ms，檢測模式使用時間分辨模式(TRF)，可以極大減弱自發熒光和其余短壽命背景雜光。

Figure 1. 上左：蛋白檢測示意圖。二抗直接使用銪元素標記。上右：銪元素-螯合物激發和發射光譜。下右：TRF檢測模式，銪元素的熒光周期與背景熒光的衰減周期對比，信號的檢測采取一定時間延遲，從而去除背景熒光干擾。

材料與方法

材料
• Scanlater Western Blot試劑盒(10X Washing Buffer, 5X Blocking Buffer, Eu-Labeled Anti-Mouse IgG, Eu-Labeled Anti-Rabbit IgG, Eu-Labeled Streptavidin)，由Molecular Devices, LLC.提供。
• Western Blot膜使用SpectraMax Paradigm或SpectraMax i3 多功能讀板機進行掃描(Molecular Devices)。
• 谷胱甘肽S-轉移酶(GST), 生物素化兔抗GST, 鼠抗-GST, 兔抗轉鐵蛋白，轉鐵蛋白(Abcam)。化學發光底物和HRP-二抗(Millipore)。
• TGX 4-20% 膠，雙標記蛋白標品，電泳緩沖液，上樣緩沖液，轉印緩沖液，蛋白轉印系統(Bio-Rad Laboratories)， Immobilon FL膜(Millipore)。

方法
• 在200V電壓下，蛋白于TGX 4-20%中，跑膠30min，之后使用Trans Blot Turbo電轉印7min到PVDF膜上，然后使用TBST漂洗30s，再用1X封閉液封閉1h。
• 一抗以一定比稀釋比例直接加到封閉液中，室溫下放置2小時或4℃過夜，1X洗液洗膜三次，每次5min。
• 二抗按照1:5000使用1X封閉液進行稀釋，然后加到膜上孵育60min，然后1X洗液洗膜三次，每次5min，最后在去離子水中漂洗15s，晾干準備進行掃描。
• 在SpectraMax Paradigm或 SpectraMax i3多功能讀板機上進行掃描檢測，使用SoftMax® Pro軟件進行分析。

靈敏度和動態檢測范圍

使用GST進行靈敏度和動態檢測范圍測試，使用1X上樣液三倍梯度稀釋GST，然后加到4-20%梯度膠中跑膠30min，然后轉印到Immobilon FL膜上，使用生物素標記的兔抗-GST標記2小時，之后與Eu-標記的鏈霉素孵育1小時，然后洗膜，晾干使用SpectraMax Paradigm多功能酶標儀進行掃描。系統表現出亞-皮克級的檢測靈敏度和>4logs的動態檢測范圍。

Figure 2. 上圖: SpectraMax Paradigm掃描的GST梯度稀釋標品圖像(注：偽彩標尺用來顯示大的動態檢測范圍)；下圖：為每個條帶的總體熒光強度，統計顯示整個動態檢測范圍為4logs，線性檢測范圍為3logs，圖像分析使用Image J。

信號穩定性

銪元素-標記的一個最突出的優點之一是信號的穩定性以及對光漂白的抗性，以致western膜印記條帶的穩定性可達數月之久。為了顯示這一點，我們將三倍梯度稀釋的轉鐵蛋白進行跑膠(4-20%梯度膠)30min，然后轉印Immobilon FL膜上，4℃與兔抗-轉鐵蛋白過夜孵育，然后與銪元素-標記的抗兔IgG 4℃孵育1小時，然后洗膜，晾干，使用SpectraMax Paradigm分別于當天和一個月之后進行掃描。

• 信號經過30天也幾乎沒有損失
• 高度可定量結果

此外，條帶可以進行多次重復掃描，信號也不會降低，將2倍梯度稀釋的轉鐵蛋白跑膠(4-20%梯度膠)30min，然后轉印Immobilon FL膜上，與兔抗-轉鐵蛋白孵育2小時，然后與銪元素-標記的抗兔IgG 4℃孵育1小時，然后洗膜，晾干，使用SpectraMax Paradigm進行多次掃描。

應用
• 使用Scanlater Western Blot技術檢測痕量表達的內源性泛素化Rad-18蛋白(參與UV-損傷DNA修復過程)。

Figure 5. 使用不同濃度(0, 50, 100 ppm)的致癌物MMS(一種烷化劑)處理HEK293細胞，然后分別使用Scanlater TRF法和化學發光法進行檢測和結果對比(Stanford University)。

• 使用ScanLater Western Blot技術檢測痕量內源性的磷酸化的pChk1(參與UV & MMS-損傷DNA修復過程)。

Figure 6. 檢測分別使用致癌物MMS和UV輻射處理的HEK-293細胞中磷酸化的pChk1(Stanford University)。

• 使用ScanLater Western Blot技術檢測信號轉導過程細胞刺激和抑制過程中產生的痕量內源性的磷酸化的JNK1蛋白；

Figure 7. 檢測刺激和抑制后的自然人類肺成纖維細胞(NHFL)中的磷酸化的JNK1蛋白 (結果來自試用客戶)。

總結
• 靈敏度：能夠檢測超低含量的人類細胞當中的內源性的磷酸化和泛素化的蛋白；
• 背景消除：銪元素時間分辨熒光標記，具有超長熒光壽命，至1ms級，使用TRF檢測模式能夠極大地降低自發熒光和其他來源的背景噪聲；
• 節省時間：無需進行ECL般的耗時優化過程；
• 降低成本：不再需要成本高昂的X-射線膠片和顯影劑；
• 即插即用：可隨時在SpectraMax i3或SpectraMax Paradigm多功能酶標儀上進行高性能WB檢測，極大地擴展了其在實驗室研究方面的應用。