1.  細胞系：CHO-M1細胞系，表達內源G蛋白偶聯毒草堿1膽堿受體（ATCC,M1 WT3-CRL1985）. 親本CHO-K1細胞用作陰性對照。

2.  抗體：兔抗ChRM1-PE標記，多抗（Bioss，Cat.#ABIN668656）; 兔抗-CHRM1 多抗，無標記；（Bioss，Cat.#bs-1150R）; 山羊抗兔IgG-PE標記，多抗（Life Technologies, Cat.#P2771MP）。

3.  培養基：Ham’s F12培養基（Corning cellgro, Cat.#10-080-CV）；CloneMedia-CHO-S (Molecular Devices,Cat. #K8710); Fetal Bovine Serum (Hyclone, Cat.#SH30071.03), 1% Pen/Strep/Glutamine (Life Technologies,Cat. #10378016), 450 μg/mL Geneticin, G418 (LifeTechnologies, Cat. #10131035)。

4.  反應緩沖液：10X HBSS (Life Technologies, Cat.#14065056) 無菌水稀釋，注射用。(Irvine Scientific, Cat. #9309)，20 mM HEPES (Life Technologies, Cat. #15630080).  pH 調整到7.4。

5.  FLIPR® Calcium 6 Assay Kits (Molecular Devices, Cat.#R8190)。

6.  微孔板: 6-well non-TC treated, clear-bottom plates (Greiner Bio-One, Cat. #657185); 384-well black-wall, sterile,TC-treated, clear-bottom plates (Corning, Cat. #3072)。

7.  M1 AChR agonist: Carbamoylcholine chloride or Carbachol(Sigma, Cat. #C4382)。

儀器概述

ClonePix 2 系統

1.  篩選和挑取哺乳細胞克隆的自動化系統

2.  白光和熒光成像

3.  透射光支持低對比度克隆如單層貼壁細胞成像

4.  軟件控制5對激發/發射濾光片的切換

5.  用戶自定義標準進行克隆排序

6.  目標克隆識別和挑取到96孔目標板

7.  支持懸浮和貼壁細胞的多種應用

     1.  篩選和挑取分泌抗原特異性抗體的雜交瘤細胞

     2.  細胞系開發

 

CloneSelect Imager

1.  無標記的白光細胞成像技術

2.  客觀、定量評價細胞生長

3.  簡單、容易使用的軟件界面

4.  準確獲取96孔板每個孔細胞的生長率

5.  支持多種應用：

     1.  監控細胞生長

     2.  單克隆驗證

 

FLIPR Tetra 系統

1.  標準EMCCD熒光檢測或可選ICCD熒光和化學發光檢測

2.  用戶可配置96-、384-、和1536孔板

3.  用戶可更換的懸浮細胞選項

4.  獨特的，可配置激發光學拓展了熒光種類的應用

5.  直觀、容易使用的軟件界面

 

半固體培養基培養細胞

CHO-M1和CHO-K1細胞系：CHO-M1和親本CHO-K1細胞種在CloneMedia CHO（K8710）培養基中，每孔1000個細胞，37℃培養8-10天直到離散克隆形成。新傳代的細胞和前幾代的細胞分別種在培養基中，觀察M1 GPCR的不同表達水平。

 

直接標記的方法：PE標記的CHRM1抗體隨細胞直接加到半固體培養基中。對照孔包括細胞但是沒有抗體。

 

雙抗體方法：直接標記的方法沒有效果的時候，用一抗和二抗測試可行性。非標記的rabbit anti-muscarinic抗體和PE標記的抗兔多克隆二抗隨細胞直接加到半固體培養基中。對照孔包含細胞但沒有抗體，連同僅僅含有二抗的對照孔。

 

ClonePix2系統成像和挑取表達GPCR(M1)的細胞克隆

 

ClonePix2 成像和挑取陽性（CHO-M1）和陰性（CHO-K1）細胞。明場成像識別每個克隆的位置和形態，熒光成像識別高表達的M1。對PE標記的抗體，使用Cy5通道曝光6,000ms。

無論是直接標記方法還是雙抗體方法，根據ClonePix2的記錄，CHO-M1陽性細胞產生大范圍的熒光信號。圖1顯示了M1 GPCR不同程度的表達。正如預期，親本CHO-K1細胞沒有產生熒光信號。

細胞基于形態和熒光強度被分組。挑取克隆的形態基于大小、形狀和克隆之間的鄰近度。形態學理想的克隆根據內部熒光強度排名，并設門分為四個熒光組：高、中、CHO-K1陰性和ungated（圖2）. CHO-K1陰性組被定義為背景熒光信號。所有的克隆識別對應于陰性對照孔。Ungated克隆是指低熒光信號但高于背景熒光信號的克隆。

直接標記抗體和雙抗體的方法（圖3）顯示了陽性樣品（表達M1）的熒光信號和無熒光信號的親本細胞系（圖4）。正如預期，由于一抗和二抗結合，雙抗體的方法在PE通道產生了更高的背景信號。然而ClonePix2在明場檢測細胞，然后再看細胞克隆內的熒光信號。在PE通道中識別到但在明場識別不到的物體不被當做是克隆。因此，ClonePix2系統好處是具有從背景信號中區分真實克隆的能力。

 

ClonePix2系統挑取的克隆CHO-M1儲存到含200μL Ham’s F12 media+10%FBS+G418的96孔Greiner板，而CHO-K1克隆儲存到同樣的微孔板但不包括G418。這些96孔板在CloneSelect Imager系統中成像確認細胞的轉移和生長（圖5）。細胞培養一周后再使用CloneSelect Imager分析確保細胞已經增殖（圖5和6）。細胞隨后轉移到384孔板，用FLIPR Tetra系統和鈣6試劑進行功能確認。

 

 

 

FLIPR Tetra系統驗證ClonePix2挑取細胞的M1 GPCR表達

細胞準備

ClonePix2系統挑取的細胞種到384孔，每孔25μL培養基，5,000個細胞，37℃,95%濕度和5%CO₂過夜培養。這些細胞分選為四個組：高、中、低和no M1表達。

 

加入鈣敏感熒光染料

從培養箱中取出細胞培養板，室溫平衡。25μL的FLIPR Calcium 6 染料直接加入含培養基的細胞板。這些板孔中加入2.5Mm的丙磺舒阻止有機離子轉運，37℃孵育2小時。室溫保持直到熒光讀數。

 

FLIPR Tetra 熒光成像讀板儀

孵育和室溫平衡后，放一塊板到FLIPR系統中，FLIPR系統ICCD相機捕獲熒光鈣信號，成像參數如下：

曝光（sec）          0.53

激發LED(nm)         470-495

發射濾光片(nm)       515-575

LED 強度(%)          80%

 

FLIPR 鈣6 試劑盒

每秒熒光讀數，分別在加Carbachol之前讀10個點，加40nm的Carbachol之后讀60點。Carbachol的起始濃度是終濃度的5倍。Carbachol的加入體積是12.5μL ，分液速度是20μL/sec.

 

FLIPR Calcium 6試劑盒驗證挑好的CHO-M1和CHO-K1細胞克隆

膜結合G蛋白偶聯毒草堿受體表達水平用標記PE的抗M1最新傳代細胞和初始的CHO-M1細胞，預期的結果是初始的CHO-M1細胞M1 GPCR的表達水平將大大低于最新傳代的細胞。親本的CHO-K1細胞作為陰性對照。

受配體GPCR的激活，受體構象的改變觸發胞內G蛋白的激活。活化的G蛋白具有誘導胞內的不同信使包括鈣信使的潛能。

 

ClonePix2系統挑取的不同組細胞用FLIPR Tetra系統來評價功能活性。在40nM的Carbachol條件下，鈣敏感熒光染料（FLIPR Calcium 6 Assays kit, Molecular Devices）用來評估胞漿中鈣離子隨著激活的G蛋白偶聯IP3敏感通路的變化而變化的可行性研究。歷史數據表明，40nM Carbachol 是 EC80的濃度。

 

在高熒光的CHO-M1細胞克隆中，相對背景，Carbachol產生了增加4倍的熒光讀數（圖7A）。在混合中和低熒光的CHO-M1細胞克隆中，Carbachol分別產生了4倍到2倍的熒光讀數增加（圖7B）。最后陰性對照的CHO-K1細胞，Carbachol沒有引起熒光讀數的任何變化（圖7C）。由于每組細胞，除了中和低表達熒光的混合細胞，是分別種在不同的384孔板中，在加入40nM的Carbachol之前，每孔基線熒光強度的變化都進行了背景熒光的均一化。

 

這些結果支持了在膜結合G蛋白偶聯毒草堿受體表達水平和功能活性之間的正相關性。缺乏熒光信號的CHO-K1細胞陰性對照進一步確認了ClonePix2系統能準確區分表面表達M1 GPCR 的細胞和表面沒有表達M1 GPCR的細胞。

 

總結

為了滿足高通量篩選和選擇性需求分析，GPCR轉染細胞系是細胞功能試驗強有力、獨特和規范的研究平臺。本文的結論是初步的研究揭示了ClonePix2系統能可靠地檢測GPCR不同表達水平的細胞克隆。而且，熒光強度和FLIPR Tetra系統測定的GPCR介導的胞漿內鈣離子水平的變化呈現正關聯，這些鈣離子的變化恰恰膜結合G蛋白偶聯毒草堿受體M1表達差異導致的。

 

ClonePix2系統能夠有效用于檢測和挑取不同GPCR表達水平的細胞克隆，因此為需要高質量GPCR蛋白的各種應用提供了唯一的資源，這些應用包括（1）使用高表達天然表位的抗原生產相應的抗體；（2）表達GPCRs困難的特殊GPCR家族的細胞功能分析。