高內涵成像技術在網絡集成式細胞內特征的公共數據庫（LINCS）項目中的應用-Molecular Devices ImageXpress MicroXLS
特點
1.得到單細胞水平上反映細胞生理功能的各種細胞內特征的海量數據。
2.采用免洗一步染料標記法，操作簡單、實時檢測、 結果準確。
3.使用高通量/高內涵檢測的方法，獲得海量數據，進行大數據比對分析，建立網絡集成式細胞內特征的公共數據庫，為人類對疾病的了解、新藥研發及個性化治療提供有力的數據支撐和手段。
美國國立衛生研究院NIH正在進行的建立網絡集成式細胞內特征的公共數據庫（LINCS）項目，旨在開發細胞水平上藥物特性的生物學標簽，通過監視細胞內表型的變化動態反映藥物作用機制，使我們能迅速了解個體細胞的藥物功能基因組學和藥物代謝組學的特征。
Cellarium（A Live-Cell Microarray for High-Throughput Observation of Metabolic Biosignatures） 技術是以NIH NHGRI（National Human Genome Research Institute）CEGS（Center of Excellence in Genomic Sciences）Microscale Life Sciences Center開發的技術衍生出來的，隸屬于上述NIH LINCS項目的一部分。這種技術通過單細胞代謝分析，致力于開發單細胞水平的藥物特性的代謝圖譜。The LINCS Tech U01 可以支持新一代高通量系統的發展并將數據儲存到LINCS數據庫中。利用ImageXpress® Micro 高內涵分析系統可實現快速的高分辨率圖像采集，以得到單細胞水平上反應細胞各種生物特征的數據分析和處理。
在美國NIH LINCS項目中，利用高內涵成像分析技術平臺可獲得單個細胞水平的各種生物學特征，如固定細胞中蛋白的免疫檢測、活細胞凋亡圖像分析、蛋白激酶生化分析以及細胞活力相關的生理參數，為研究者和臨床診斷醫生探測單細胞個體分析和如何用藥提供了一個獨特的工具。
流程圖
圖1概括了cellarium 技術的工作流程。首先，將細胞種到微孔中并在正常條件下進行培養（在孵育之前，要先加入實驗需要的各種刺激因子）。將傳感器微陣列壓在細胞微孔陣列上后，就完成了單細胞分離和密封的步驟了。然后，在一個精確的時間段內對芯片進行高速掃描就可以得到相應的參數包括耗氧率，胞外pH變化以及糖攝取狀況等。這些數據與癌細胞代謝，正常細胞生長發育以及一系列的人類疾病相關。此外，胞內的熒光傳感器可以擴大檢測參數的范圍，其中包括ATP等，通過高內涵圖像采集及分析系統將單細胞熒光圖像存儲并分析，得到大量單細胞生理參數。這些數據被整理并上傳到LINCS公共數據庫中，供所有的研究者查閱。
分離單細胞傳感器微陣列
傳統的大量細胞群體的生理特征測量只是細胞對刺激的平均反應，科研工作者們希望測量單個細胞水平上的生理參數，以研究細胞代謝、異質性及疾病發生早期。近期研究的單細胞代謝大部分基于熒光傳感器系統，因為這種系統是非侵入性的、一次性的、可遠程遙控的測量生化參數的方法。
應用化學方法可成功制造出各種尺寸的的圓點傳感器，小至3微米，且成功率超過90%（圖2）。以耗氧率傳感器為例，設計出了“lid-on-top”樣式的微室，微室頂部的“lid”部分按已設計好的圖案放置傳感器；細胞生長于微孔底部，微孔的直徑是固定的，在50-100微米之間，因此放置傳感器的圖形要經過精確的計算以達到高信噪比。“lid”部分安放在PDMS（polydimethylsiloxane）材料的活塞上，蓋上活塞時機械力可在包含傳感器的”lid”和芯片底部的細胞之間產生密封效果。當光從芯片下方照射時，測量并記錄傳感器激發強度，且此強度與微室中氧濃度有對應關系，經過計算就可得到氧氣濃度（圖3）。
圖2 Lid-on-top結構示意圖。傳感器按一定圖案放置于頂部的lid，將有細胞的微室底部分成更小的范圍，形成單細胞區域。
圖3 單細胞耗氧率動態代謝檢測及分析
一步染色法檢測細胞對藥物的敏感性
應用ImageXpress® Micro高內涵成像系統可快速、方便、高通量的測量細胞對小分子藥物的多參數生理變化，并且使用三種熒光染料對活細胞進行染色，只需一步，無需清洗，對于貼壁性不好的有絲分裂細胞和凋亡細胞，這種方法比傳統的基于免疫熒光染色的方法更加準確。應用此法得到的數據已經上傳到NIH的LINCS公共數據庫中(http://lincs.hms.harvard.edu/)。
在傳統免疫熒光法和一步熒光染料法的對比實驗中，免疫熒光法用phospho(Ser10) Histone H3標記有絲分裂細胞，antcleaved PARP1標記凋亡細胞。染料法用LysoTracker-Red顯示細胞形態，DEVDNucView488 caspase-3標記凋亡細胞。兩種方法均用Hoechst 33342標記細胞核。免疫熒光法是將細胞固定后進行抗體染色步驟，包括沖洗板子，而熒光染料法是染色后再固定細胞，并且在采集圖像前沒有沖洗的步驟。
實驗中用典型的抗有絲分裂藥物紫杉醇處理人膀胱癌5637細胞（圖4）。在無藥物的對照組，這兩種實驗方法的結果十分相近，包括細胞密度、細胞核形態、%有絲分裂、%凋亡細胞。在紫杉醇處理24小時后，兩種實驗方法中的有絲分裂細胞數均顯示出明顯增加。但是，凋亡細胞數在免疫熒光法中明顯少于熒光染料法。這說明免疫熒光法沖洗板子的過程雖然可以有效的保留有絲分裂細胞，但會使凋亡細胞損失。為了證明這一結論，我們用紫杉醇處理細胞48小時后，用熒光染料法染色，先按正常程序不沖洗，采集下圖像后，再用PBS沖洗三次模擬免疫熒光法，采集同樣位置的圖像，沖洗前后的圖像對比如圖4C所示。沖洗后，NucView488陽性細胞大量減少，另外，洗前的圖像中有很多圓形、脹大、模糊的被LysoTracker-Red和NucView488染色很弱的核，而在沖洗后這些核完全丟失了。從細胞形態及染色情況看，這些應屬于晚期凋亡細胞。
接下來我們評估了熒光染色高內涵法的自動表型算法（圖5）。5637細胞分別經過DMSO、200nM紫杉醇處理24小時、200nM紫杉醇處理48小時。不同表型的細胞被不同顏色輪廓標記出來：分裂間期細胞為白色，有絲分裂細胞為紅色，早期凋亡細胞為綠色，晚期凋亡細胞為黃色。為了評估自動分析的準確性，我們從每種處理中隨意挑選了12張圖片進行手動計數，作為標準與自動分析結果進行比較。結果顯示兩種計算方法非常相近，雖然自動分析中間期細胞數量略高，有絲分裂和凋亡細胞數量略低，但是誤差很小，并不影響藥物評價。
圖4 人類膀胱癌5637細胞基于抗體和基于染料的實驗對比。（A）基于抗體和基于染料的實驗中單一通道和疊加圖像的對比，DMSO對照（左）和200nM紫杉醇（右）處理24小時。（B）柱狀圖顯示了兩種實驗方法在DMSO和200nM紫杉醇處理24小時處理后的對比，對比參數包括總細胞數、有絲分裂細胞數和凋亡細胞數。所有的細胞計數都是每孔統計了超過4個視野，并取超過48個重復孔的平均值得到的。（C）細胞被200nM紫杉醇處理48小時后用染料染色，對比實驗孔板在沖洗前后同一位置單一通道和疊加圖像。
圖5 染色實驗方法的圖像自定義分析分割結果。5637細胞在DMSO、200nM紫杉醇處理24小時和200nM紫杉醇處理48小時后的原始圖像（上）和Hoechst分析圖像（下）。分裂間期細胞為白色，有絲分裂細胞為紅色，早期凋亡細胞為綠色，晚期凋亡細胞為黃色。（B）自動分析（藍色）和手工計數（紅色）的比較，依次為總細胞數、有絲分裂細胞數、凋亡細胞數和晚期凋亡細胞數。所有的細胞數均為超過12個圖像的平均值。
單細胞分析的未來
目前科學界認為，如果能深入了解單細胞的行為以及它們和微環境的相互作用，就能衍生出很多具有沖擊性的發現。從近來的綜述性文章我們可以發現，研究單細胞分析技術尤其是從傳統細胞研究方法向高通量單細胞分析方法轉變是必要的。
LINCS項目不僅擁有全新的高通量平臺測序技術及平臺，包括ImageXpress® Micro高內涵成像分析系統等，使之可以準確找到如單細胞代謝率的生物學標簽的實時信號改變；更重要是在于對進行大規模數據庫的建立和大數據的分析，使我們在后基因組時代進一步加快了轉錄組學、蛋白組學及單細胞代謝組學等的發展。LINCS技術得到的海量數據信息和分析比對結果將極大影響人類對生命科學的研究及對人類疾病的了解，從而進一步改善人類的環境、醫療及健康狀況。與此同時，也為制藥/診斷公司提供了一個商業契機，可以利用LINCS技術平臺為研究者或臨床醫生提供更為準確可靠的生物學數據或個性化的診斷數據。
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