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細胞凋亡(TUNEL,TUNEL染色)檢測技術簡介

瀏覽次數:4900 發布日期:2014-2-18  來源:本站 僅供參考,謝絕轉載,否則責任自負

細胞凋亡是指為維持內環境穩定,  生物體內細胞在特定的內源或外源信號誘導下,其死亡途徑被激活,并在有關基因的調控下發生的程序性死亡過程。細胞凋亡是程序性死亡過程的一種主要形式,它涉及染色質凝聚和外周化、細胞質減少、核片段化、細胞質致密化、與周圍細胞聯系中斷、內質網與細胞膜融合,最終細胞片段化形成許多細胞凋亡體。

細胞凋亡用(TUNEL,TUNEL染色)(TdT-mediated dUTP nick end labeling)細胞凋亡檢測試劑盒來檢測。細胞凋亡檢測試劑盒是用來檢測組織細胞在凋亡早期過程中細胞核DNA的斷裂情況。細胞凋亡檢測其原理是熒光素標記的12-dUTP在末端脫氧核苷轉移酶(TdT)的作用下,連接到凋亡細胞中斷裂的DNA的3’-OH末端,利用由熒光顯微鏡或者流式細胞檢測儀檢測凋亡的發生。

細胞凋亡與壞死是兩種完全不同的細胞凋亡形式,細胞凋亡不是一件被動的過程,而是主動過程,它涉及一系列基因的激活、表達以及調控等的作用,它并不是病理條件下,自體損傷的一種現象,而是為更好地適應生存環境而主動爭取的一種死亡過程。細胞凋亡是細胞的一種基本生物學現象,在多細胞生物去除不需要的或異常的細胞中起著必要的作用。它在生物體的進化、內環境的穩定以及多個系統的發育中起著重要的作用。細胞凋亡不僅是一種特殊的細胞死亡類型,而且具有重要的生物學意義及復雜的分子生物學機制。凋亡是多基因嚴格控制的過程。

根據死亡細胞在形態學、生物化學和分子生物學上的差別,可以將二者區別開來。細胞凋亡的檢測方法有很多,下面介紹幾種常用的測定方法。 

一、細胞凋亡的形態學檢測

根據凋亡細胞固有的形態特征,人們已經設計了許多不同的細胞凋亡形態學檢測方法。

1 光學顯微鏡和倒置顯微鏡
檢測細胞凋亡:
(1) 未染色細胞:凋亡細胞的體積變小、變形,細胞膜完整但出現發泡現象,細胞凋亡晚期可見凋亡小體。貼壁細胞出現皺縮、變圓、脫落。
(2) 染色細胞:常用姬姆薩染色、瑞氏染色等。凋亡細胞的染色質濃縮、邊緣化,核膜裂解、染色質分割成塊狀和凋亡小體等典型的凋亡形態。

2 熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡拍細(胞凋亡)結果:

一般以細胞核染色質的形態學改變為指標來評判細胞凋亡的進展情況。

常用的DNA特異性染料有:HO 33342 (Hoechst 33342),HO 33258 (Hoechst 33258), DAPI。三種染料與 DNA的結合是非嵌入式的,主要結合在DNA的A-T堿基區。紫外光激發時發射明亮的藍色熒光。


Hoechst是與DNA特異結合的活性染料,儲存液用蒸餾水配成1mg/ml的濃度,使用時用PBS稀釋成終濃度為2~5mg/ml。

DAPI為半通透性,用于常規固定細胞的染色。儲存液用蒸餾水配成1mg/ml的濃度,使用終濃度一般為0.5 ~1mg/ml。

結果評判:細胞凋亡過程中細胞核染色質的形態學改變分為三期:Ⅰ期的細胞核呈波紋狀(rippled)或呈折縫樣(creased),部分染色質出現濃縮狀態;Ⅱa期細胞核的染色質高度凝聚、邊緣化;Ⅱb期的細胞核裂解為碎塊,產生凋亡小體。

3 透射電子顯微鏡觀察|細胞凋亡:
結果評判:凋亡細胞體積變小,細胞質濃縮。細胞凋亡Ⅰ期(pro-apoptosis nuclei)的細胞核內染色質高度盤繞,出現許多稱為氣穴現象(cavitations)的空泡結構;細胞凋亡Ⅱa期細胞核的染色質高度凝聚、邊緣化;細胞凋亡的晚期,細胞核裂解為碎塊,產生凋亡小體。

二、磷脂酰絲氨酸外翻分析(Annexin V法)檢測|細胞凋亡:

Annexin V/PI雙染檢測|細胞凋亡


磷脂酰絲氨酸(Phosphatidylserine, PS)正常位于細胞膜的內側,但在細胞凋亡的早期,PS可從細胞膜的內側翻轉到細胞膜的
表面,暴露在細胞外環境中。Annexin-V是一種分子量為35~36KD的Ca2+依賴性磷脂結合蛋白,能與PS高親和力特異性結合。因此 Annexin V 被作為檢測細胞早期凋亡的靈敏指標之一。將Annexin-V進行熒光素(FITC、PE)或biotin標記,以標記了的Annexin-V作為熒光探針,利用流式細胞儀或熒光顯微鏡可檢測細胞凋亡的發生。


碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一種核酸染料,它不能透過完整的細胞膜,但在凋亡中晚期的細胞和死細胞,PI能夠透過細胞膜而使細胞核紅染。因此將Annexin-V與PI匹配使用,就可以將凋亡早晚期的細胞以及死細胞區分開來。

Annexin V/PI檢測|細胞凋亡|優勢:和其他凋亡檢測方法相比,Annexin V/PI雙染可以輕

松區分細胞凋亡和壞死,并在凋亡早期進行檢測,靈敏度高。

發布者:威斯騰生物技術服務中心
聯系電話:400-675-6758
E-mail:western68@163.com

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