Xevo G2-S QTof和TransOmics：用于蛋白質組學、代謝組學和脂質組學的LC/MS差異組學分析系統
Ian Edwards、Jayne Kirk和Joanne Williams
沃特世公司(英國曼徹斯特)

應用優勢
■簡化了工作流程、驗證和數據解析
■設計用于大規模代謝組學和蛋白質組學數據集
■集成式組學平臺可用于各種各樣的全面定性和定量分析

沃特世解決方案
包括TransOmics™信息學軟件的組學研究平臺解決方案
ACQUITY UPLC® I-Class 系統
nanoACQUITY UPLC®系統
Xevo® G2-S QTof
TransOmics信息學軟件
MassPREP™蛋白質酶解標準品

關鍵詞
組學，代謝組學，脂類組學，蛋白質組學，MS^E，主成分分析，無標記LC/MS

簡介
近年來，包括基于LC-MS的代謝組學、脂質組學和蛋白質組學儀器等組學技術的進步實現了以高通量的方式對多種生物分子的豐度進行定量監測，從而測定它們在不同生物狀態下的變化。

我們的最終目標是增進對生物過程的理解，從而改善對于疾病的療效，更有效地開發藥物或維持作物生長的最佳農業環境，同時最大程度地減少傳染和其它副作用。就此而言，不同分析學科的研究結果可提供正交的觀點，通常可以互相作為補充。開發和應用能夠將多個研究領域的結果進行整合的靈活信息學解決方案具有重大意義。本研究介紹了一種多組學解決方案，可用于對代謝組學和蛋白質組學數據集中的MS數據進行大規模分析。

其中采用了包括TransOmics信息學軟件的沃特世(Waters®)組學研究平臺解決方案，并結合Xevo G2-S QTof系統進行技術和生物學重復分析。

結果與討論
執行的代謝組學實驗包括相對于對照/質控樣品，鑒定低劑量和高劑量樣品。根據實驗設計，樣品應當劃分為3個不同的組，并使用標記離子進行不同組的識別。用于代謝組學和脂類組學的TransOmics (TOIML)流程包括以下步驟：

1. 導入原始的MS^E連續數據集(六個技術重復樣/組)
2. 峰對齊，糾正不同分析運行間的保留時間偏移
3. 色譜峰歸一化，以便在不同樣品運行間進行比較
4. 色譜峰檢測(峰選擇)
5. 離子去卷積，按化合物將離子分組
6. 利用已有的定制數據庫進行化合物鑒定
7. 執行數據分析，找出用以將化合物分為QC(質控)、空白(基質)和分析物(高劑量)的離子(特征)

基質背景包括系統評估基質，其中加入了不同的鎮痛標準品混合物A，從而得到低劑量(QC和高劑量(空白)樣品。質控樣品(QC)通過混合等量的低劑量和高劑量樣品而制成。

采用ACQUITY UPLC I-Class系統結合Xevo G2-S QTof，在正電噴霧模式下以大于30k FWHM的質量分辨率，分離和分析代謝物。在UPLC/MS^E模式下采集數據，該模式是一種無監督的采集方法，其中當進行交替掃描時質譜儀在低能量和高能量之間切換。使用TOIML和專業化合物數據庫進行處理、搜索和定量。

其中TOIML流程的步驟1，2和3在別處有詳細描述(TransOmics信息學軟件由Nonlinear Dynamics提供技術支持)。鑒定前，通過主成分分析對所檢測離子進行分組，如圖1所示，顯示了綜合得分圖和載荷圖。從中可知，離子主要聚集在技術重復水平，并且樣品實現了清晰分離。

圖1. 分析物(鎮痛標準品混合物A高劑量；紫色)，空白(系統評估基質；淺藍色)和QC(質控樣品；深藍色)的主成分分析

接著，采用集成式搜索工具進行化合物鑒定，以正確鑒定四種鎮痛標準品混合物中可在正離子電噴霧模式下檢測到的標準品。圖2展示了TOIML化合物搜索結果頁面的概覽，其中突出顯示了基于精確質量數、保留時間(可選)和理論同位素模式分布對咖啡因的鑒定。

除了先前描述的PCA之外，TOIML中還整合了其它多變量統計工具，包括相關性和趨勢分析。圖3為一個示例，示出了四個加標標準品的歸一化趨勢圖，表明每個標準品的六個技術重復樣之間有著良好的一致性，并且相對豐度與實驗設計一致。

此外，TOIML還便于科學家將分析結果與其它組學數據關聯，或為諸如EZinfo的獨立統計軟件包提供輸入數據。下游生物信息學(即Umetrics軟件)的結果可重新導入分析實驗中，以將所有化合物數據合并為單個表格以供審查或分享。

圖2. TOIML化合物鑒定頁面。

圖3. 鎮痛標準品的歸一化豐度分析。

在蛋白質組學實驗中，分析了兩個10 ng大腸桿菌樣品的三個重復樣，分別加入了牛血清白蛋白(BSA)、乙醇脫氫酶(ADH)，烯醇酶和糖原磷酸化酶B。第一個樣品(混合物1)中的加標蛋白質的柱上進樣量均為1飛摩爾，而第二個樣品(混合物2)中的加標蛋白質柱上進樣量分別為8、1、2和0.5飛摩爾。

因此，額定預期比值(混合物2:混合物1)應為8:1、1:1、2:1和0.5:1。在本研究中，使用nanoAC-QUITY UPLC系統結合Xevo G2-S QTof，在LC/MS^E采集模式下對肽進行分離和分析。采用用于蛋白組學的TransOmics (TOIP)以及含有加標蛋白質序列信息的種屬特異性數據庫進行處理、搜索和定量。

TOIP流程包括以下步驟：
1. 導入原始的MS^E連續數據集(每個樣品有三個技術重復樣)
2. 峰對齊，糾正不同分析運行間的保留時間偏移
3. 色譜峰歸一化，以便在不同樣品運行間進行比較
4. 色譜峰檢測(峰選擇)
5. 利用集成數據庫搜索算法鑒定蛋白質和肽
6. 多變量統計分析
7. 絕對和相對定量

TOIP提供了與TOIML相同的多變量分析工具。圖4顯示了所檢測特征的PCA示例，即電荷態組。可明顯看出，特征主要聚集在技術重復水平。其中一種加標蛋白質消化物的肽定性鑒定結果示于圖5中，該蛋白質中鑒定出的所有肽的歸一化表達譜如圖6所示。對后者的定量精確度類型進行了確證，此類型可通過無標記MS研究及基于LC/MS^E的采集策略獲得。

圖5顯示了差異加標樣品中一個分析物的LC/MS^E采集的定性結果概覽。在本例中，BAS的柱上進樣量為8 fmol，而大腸桿菌消化物的量為10 ng。結果如圖6所示，展示了相關的相對定量結果。

圖4. 大腸桿菌中加入的混合物1(深藍色)和混合物2(淺藍色)的特征(電荷態組)PCA圖。

圖5. 大腸桿菌中加入的不同濃度牛血清白蛋白肽的定性LC/MS^E鑒定結果。順時針顯示的依次是鑒定相關指標(得分和誤差)、具體的輪廓線圖以及標注的產物離子譜圖。

圖6. 牛血清白蛋白中鑒定出的肽的定量分析。

結論
■TransOmics信息學軟件為多組學研究提供了一個簡單易用、可擴展的系統
■UPLC/MS^E(LC結合數據獨立型采集MS)可在單次實驗中提供全面的定性和定量數據集
■通過代謝物、脂質和蛋白質分析可快速獲取補充信息并進行關聯

下載清晰應用紀要請點擊： http://www.waters.com/waters/library.htm?lid=134747751&cid=511436