多光子共聚焦掃描顯微鏡的原理以及應用
多光子共聚焦顯微鏡是光學顯微鏡的重大改進，主要表現為可以觀察活細胞、固定細胞和組織的深層結構，并且可以得到清晰銳利的多層Z平面結構，即光學切片，并以此可以構建標本的三維實體結構。共聚焦顯微鏡采用激光光源，經過擴充后充滿整個物鏡后焦平面，然后經過物鏡的透鏡系統，在標本的焦平面上會聚成非常小的點。根據物鏡數值孔徑不同，最亮照明點直徑大小約0.25 ~ 0.8μm，深度約0.5 ~ 1.5μm。共聚焦點大小決定于顯微鏡設計、激光波長、物鏡特性、掃描單元狀態設定和標本性質。場式顯微鏡的照明范圍和照明深度都很大，而共聚焦顯微鏡的照明則集中到焦平面上的一個精確的焦點上。共聚焦顯微鏡最基本的優點是可以對厚熒光標本（可以達到50 μm或以上）進行精細的光學切片，切片的厚度約為0.5到1.5μm。系列光學切片圖像可以通過精確的顯微鏡Z軸步進馬達上下移動標本獲得。圖像信息的采集被控制在精確的平面內，而不會被位于標本上其他位置發出的信號干擾。在去除背景熒光影響和增加信噪比后，共聚焦圖像的對比度和分辨率比傳統場式照明熒光圖像有明顯的提高。在很多標本中，許多錯綜的結構成分相互交織構成復雜的系統，僅用幾張光學切片很難還原標本本身的結構特征，但是一旦能夠采集到足夠的光學切片，我們就能通過軟件對其進行三維重建。這種實驗方法已經被廣泛應用與生物學研究中，用來闡明細胞或組織之間復雜的結構和功能關系。
與傳統光學顯微鏡相比，多光子共聚焦顯微鏡具有更高的分辨率，實現多重熒光的同時觀察并可形成清晰的三維圖象等優點。所以它問世以來在生物學的研究領域中得到了廣泛應用。在對生物樣品的觀察中，多光子顯微鏡有其優越性：對活細胞和組織或細胞切片進行連續掃描，可獲得精細的細胞骨架、染色體、細胞器和細胞膜系統的三維圖像。可以得到比普通熒光顯微鏡更高對比度、高解析度圖象、同時具有高靈敏度、杰出樣品保護。多維圖象的獲得，如7 維圖象(XYZaλIt): xyt、xzt 和xt 掃描,時間序列掃描旋轉掃描、區域掃描、光譜掃描、同時方便進行圖像處理。細胞內離子熒光標記，單標記或多標記，檢測細胞內如PH和鈉、鈣、鎂等離子濃度的比率測定及動態變化。熒光標記探頭標記的活細胞或切片標本的活細胞生物物質，膜標記、免疫物質、免疫反應、受體或配體，核酸等觀察；可以在同一張樣品上進行同時多重物質標記，同時觀察。對細胞檢測無損傷、精確、準確、可靠和優良重復性；數據圖像可及時輸出或長期儲存。
當前，激光共聚焦顯微鏡較廣泛應用的研究領域有：細胞生物學：如：細胞結構、細胞骨架、細胞膜結構、流動性、受體、細胞器結構和分布變化、細胞凋亡機制；各種細胞器、結構性蛋白、DNA、RNA、酶和受體分子等細胞特異性結構的含量、組分及分布進行定量分析；DNA、RNA含量、利用特定的抗體對紫外線引起的DNA損傷進行觀察和定量；分析正常細胞和癌細胞骨架與核改變之間的關系；細胞黏附行為等。生物化學：如酶、核酸、受體分析、熒光原位雜交、雜色體基因定位等，利用共聚焦技術可以取代傳統的核酸印跡染交等技術，進行基因的表達檢測，使基因的轉錄、翻譯等檢測變的更加簡單、準確。藥理學：如藥物對細胞的作用及其動力學；藥物進入細胞的動態過程、定位分布及定量。生理學、發育生物學：如膜受體、離子通道、離子含量、分布、動態；動物發育以及胚胎的形成，骨髓干細胞的分化行為；細胞膜電位的測量，熒光漂白恢復（FRAP）的測量等。遺傳學和組胚學：如細胞生長、分化、成熟變化、細胞的三維結構、染色體分析、基因表達、基因診斷。神經生物學：如神經細胞結構、神經遞質的成分、運輸和傳遞。微生物學和寄生蟲學：如細菌、寄生蟲形態結構。病理學及病理學臨床應用：如活檢標本的快速診斷、腫瘤診斷、自身免疫性疾病的診斷。免疫學、環境醫學和營養學：如免疫熒光標記（單標、雙標或三標）的定位，細胞膜受體或抗原的分布,微絲、微管的分布、兩種或三種蛋白的共存與共定位、蛋白與細胞器的共定位；對活細胞中的蛋白質進行準確定位及動態觀察可實時原位跟蹤特定蛋白在細胞生長、分裂、分化過程中的時空表達。
與傳統光學顯微鏡相比，多光子共聚焦顯微鏡具有更高的分辨率，實現多重熒光的同時觀察并可形成清晰的三維圖象等優點。所以它問世以來在生物學的研究領域中得到了廣泛應用。在對生物樣品的觀察中，多光子顯微鏡有其優越性：對活細胞和組織或細胞切片進行連續掃描，可獲得精細的細胞骨架、染色體、細胞器和細胞膜系統的三維圖像。可以得到比普通熒光顯微鏡更高對比度、高解析度圖象、同時具有高靈敏度、杰出樣品保護。多維圖象的獲得，如7 維圖象(XYZaλIt): xyt、xzt 和xt 掃描,時間序列掃描旋轉掃描、區域掃描、光譜掃描、同時方便進行圖像處理。細胞內離子熒光標記，單標記或多標記，檢測細胞內如PH和鈉、鈣、鎂等離子濃度的比率測定及動態變化。熒光標記探頭標記的活細胞或切片標本的活細胞生物物質，膜標記、免疫物質、免疫反應、受體或配體，核酸等觀察；可以在同一張樣品上進行同時多重物質標記，同時觀察。對細胞檢測無損傷、精確、準確、可靠和優良重復性；數據圖像可及時輸出或長期儲存。
當前，激光共聚焦顯微鏡較廣泛應用的研究領域有：細胞生物學：如：細胞結構、細胞骨架、細胞膜結構、流動性、受體、細胞器結構和分布變化、細胞凋亡機制；各種細胞器、結構性蛋白、DNA、RNA、酶和受體分子等細胞特異性結構的含量、組分及分布進行定量分析；DNA、RNA含量、利用特定的抗體對紫外線引起的DNA損傷進行觀察和定量；分析正常細胞和癌細胞骨架與核改變之間的關系；細胞黏附行為等。生物化學：如酶、核酸、受體分析、熒光原位雜交、雜色體基因定位等，利用共聚焦技術可以取代傳統的核酸印跡染交等技術，進行基因的表達檢測，使基因的轉錄、翻譯等檢測變的更加簡單、準確。藥理學：如藥物對細胞的作用及其動力學；藥物進入細胞的動態過程、定位分布及定量。生理學、發育生物學：如膜受體、離子通道、離子含量、分布、動態；動物發育以及胚胎的形成，骨髓干細胞的分化行為；細胞膜電位的測量，熒光漂白恢復（FRAP）的測量等。遺傳學和組胚學：如細胞生長、分化、成熟變化、細胞的三維結構、染色體分析、基因表達、基因診斷。神經生物學：如神經細胞結構、神經遞質的成分、運輸和傳遞。微生物學和寄生蟲學：如細菌、寄生蟲形態結構。病理學及病理學臨床應用：如活檢標本的快速診斷、腫瘤診斷、自身免疫性疾病的診斷。免疫學、環境醫學和營養學：如免疫熒光標記（單標、雙標或三標）的定位，細胞膜受體或抗原的分布,微絲、微管的分布、兩種或三種蛋白的共存與共定位、蛋白與細胞器的共定位；對活細胞中的蛋白質進行準確定位及動態觀察可實時原位跟蹤特定蛋白在細胞生長、分裂、分化過程中的時空表達。
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