關于PCR內參基因選擇策略
關于內參基因的選擇很多初級的實驗人員很少會去思考這個問題，因為擺在面前的只有兩種選擇，β-actin和GAPDH，甚至在很多人長期的觀念中對于內參的認知也僅僅停留在是一個表達量相對較高較穩定的看家基因，對于分子層面相對表達量的一個重要參照而已，至于為什么要選這兩種，還有沒有其他的內參，人們的回答往往是“Sorry，I don’t care.”或者“我的前輩就是這樣用的，別的文獻是這樣寫的，有問題嗎？”。
有問題嗎？BioTNT要在這里大聲的疾呼“有，而且是很大的問題。”當人們檢測某個基因的表達降低或者提高得出結果以后，你并不知道是它本身的表達量發生變化，還是因為樣本量大小或者操作導致RNA的損失等其他原因導致的表達量變化，所以這個時候需要同時檢測另外的基因作為參照。這另外的基因就是內參基因。
于是，從我們本身科學的要求來看，理想的內參就會有這樣幾個條件，1、表達量較大；2、穩定表達于不同類型的細胞和組織；3、表達水平與細胞周期以及細胞是否活化無關；4、不受任何內源性或外源性因素的影響；5、不存在假基因，以避免基因組 DNA 的污染擴增。請注意這是理想的內參，讓我們來一個一個看看我們常見的經典內參是不是真的夠理想呢？
第一，是β-actin，即β肌動蛋白。我們先要來看看actin是什么，所謂的actin肌動蛋白，是細胞的一種重要骨架蛋白，大致可分為六種，其中四種是不同肌肉組織特異性的，包括α-skeletal （骨骼）、cardiac （心）、smooth （平滑）muscle actin和γ-smooth muscle actin，其余兩種廣泛分布于各種組織中，包括 β- actin和γ-non-muscle actin。這些不同的亞型組織分布是不一樣的，在肌肉組織中的beta-actin分布就很少，心肌主要是α-cardiac muscle actin。顯而易見，如果我的研究模型是心或者是骨骼，β-actin作為內參顯然就不合適。有研究表明，當細胞向惡性轉化時，β-actin的mRNA的表達水平增加，很明顯這與腫瘤細胞易增殖，會遷移的特性從理論上也對的起來，BioTNT在平時接觸以腫瘤組織為樣本的實驗中，雖然已經控制了組織濕重，但是正常組和腫瘤組間的β-actin的表達差異還是相當大的，這又進一步限制了β-actin的適用范圍，另外β-actin也是為數不多的幾個要注意假基因污染的內參。隨著對β-actin研究的深入，過去常被認為是表達穩定，表達量高的β肌動蛋白實際上并不那么穩定，包括一些肝組織的內臟組織中的β-actin也不是內參的最佳選擇。
第二，是GAPDH。我們再來看下GAPDH，3-磷酸甘油醛脫氫酶，糖酵解過程中的一種反應酶，也是幾乎在所有組織細胞中高表達，且表達量幾乎不變，是細胞代謝途徑中不可或缺的一個基因，但也正是因為其在糖酵解中扮演不可忽視的角色，導致了其被在牽涉到該代謝過程的所有內源和外源因素影響是及其明顯的，比如，最最典型的細胞分裂時期的細胞，在不同細胞周期中GAPDH的表達呈顯著性變化，因為同樣原因，迅速分裂增殖的腫瘤細胞樣本也是很難用GAPDH作為恒定表達內參來使用，還有在相關外源因素 (例如低氧、胰島素、地塞米松、絲裂原、表皮生長因子等 )刺激下，GAPDH的mRNA表達水平也不同，這使得GAPDH在某些實驗中還不如β-actin來的穩定。
現在，問題就非常明確了，過去我們曾非常依賴的兩大內參或多或少甚至在某些地方存在著致命的缺陷，比如說腫瘤細胞的研究，似乎無法使用任何一種常規內參了，這如何去解決呢？所以BioTNT在這里將例舉20中常用內參，并小解其中的一兩個以作例證。
第三，18S rRNA 和 28S rRNA。由于 rRNA 是由一種不同于mRNA合成的RNA聚合酶所合成。因此rRNA合成的調節獨立于mRNA，在影響mRNA表達的各種條件下，各種 r RNA水平很少發生變化，在腫瘤樣本中，用rRNA作為內參也許是一個不錯的選擇。但是rRNA同時也存在著諸多問題，比如當對已純化mRNA中的目標基因進行定量時，rRNA由于在純化過程中被去除而不能用于標準化，再如，從結構上講rRNA不包括poly(A)尾，所以從理論上講在以oligo(dT)為引物的cDNA合成中不能被逆轉錄。但是說到這里，BioTNT也曾試過用oligo(dT)為引物逆轉錄rRNA，并且能夠成功擴增出cDNA，且表達量并不低，所以BioTNT一直對于這點有困惑，但是就rRNA本身作為內參來使用這點，BioTNT還是小小推薦一下，在遇到樣本量少，樣本質量略低等等特殊情況，用rRNA作為內參相較還要優于β-actin和GAPDH。
第四，其他內參。有研究學者對67例肝組織研究, 發現UBC（泛素）和HMBS（膽色素原脫氨酶）對于肝組織的表達分析是最佳選擇。在白血病、正常、惡性腫瘤中比較β-actin、β2-MG和PBGD （膽色素原脫氨酶），發現β2-MG最合適作為內參。PRKG1和TBP是適合于在B和T細胞及其腫瘤中控制RNA的質量和產量……。所以，不同的內參基因在不同的條件都有成為合適內參的潛能。在一組給定的標本或實驗條件中, 平行測定2個或以上內參的表達量有助于發現和減小系統誤差。
綜上所述，當我們進一步對不同種類的看家基因進行內參篩選和研究的時候就會發現，內參世界比我們想象的要更為復雜，當我們所研究的對象從原核到真核，從細胞到組織，從正常到惡化，所有改變的條件對于我們內參的選擇就是一次篩選，現實并不存在一種適合所有條件和樣本類型的萬能內參，BioTNT覺得以雙內參或者甚至三內參、四內參進行實驗從理論上講更科學、更能減小誤差。
就內參的進一步研究，BioTNT在這里就不一一展開了，實際上BioTNT在幾年前就已經看到有國外做qPCR時選取4個內參作平均值得到的數據作為調整內參得到更可靠地修正值這一做法，證明已經有人意識到并且去試驗這種更科學的做法，BioTNT雖只是一家之言，但也僅此希望能夠有更多的人能夠在實驗前就已經認識到內參的重要性，并提前規避可能因為內參選擇不當而導致后期實驗數據沒有意義的情況發生。
另，如果大家有感興趣的，可以查找一些關于內參的大家的綜述或論文。
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PCR內參基因
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