通過SpectraMax Paradigm微孔板檢測平臺和Tune技術(shù)可自動掃描熒光蛋白分子來確定其最佳波長
Molecular Devices公司基于SpectraMax ®Paradigm® 多功能微孔板檢測平臺的基礎(chǔ)上推出了一款使用濾光片作為其單色器，但又可隨意調(diào)節(jié)其檢測波長的Tune卡盒，這種最新的檢測技術(shù)融合了濾光片的高靈敏度和波長掃描的高靈活性等特點。Tune檢測卡盒克服了傳統(tǒng)光柵型單色器的缺陷，可以方便研究人員在更廣的波長范圍內(nèi)優(yōu)化各種試驗所需的最佳波長，且檢測靈敏度也較光柵型系統(tǒng)提高了10倍以上。Tune卡盒激發(fā)光波長范圍360nm至790nm，發(fā)射波長范圍400nm至850nm，且可以做到1nm步進，它也是一種多功能檢測卡盒，除具有熒光強度（FI）檢測模式外，還具有時間分辨熒光（TRF）和化學(xué)發(fā)光（Lum）檢測模式。
SpectraMax Paradigm 檢測平臺融合了全新Tune檢測技術(shù)
具有專利的光譜優(yōu)化向?qū)Чδ芸珊喕斯ぷ髁鞒蹋瘁槍Σ煌瑹晒馊玖戏肿訏呙韬笞詣佑嬎愠鲂盘柵c背景的比值，找出此熒光染料分子的最佳激發(fā)與發(fā)射波長。軟件會自動生成掃描熱圖，給出根據(jù)不同掃描波長對計算后的信號與背景比值，方便用戶選擇最優(yōu)波長來完成試驗，當使用EGFP熒光染料分子進行波長的自動優(yōu)化設(shè)置后，其檢測靈敏度較使用傳統(tǒng)固定波長的方法提高了80倍以上。
激發(fā)和發(fā)射光譜掃描
單獨針對兩個綠色熒光蛋白的突變體進行激發(fā)和發(fā)射波長掃描，分別將重組野生型 GFP （Clontech） 和增強型GFP（EGFP，BioVision）都用TE緩沖液都稀釋至 10μg/ml， PH調(diào)為8 。為測量GFP樣品（50ul）光譜學(xué)特性將其加入黑色384孔板中，黑色微孔板中僅含有緩沖液的孔作為參比孔。
單獨進行激發(fā)和發(fā)射光譜掃描時，將測量時間（Integration Time）設(shè)置為140ms。當確定最佳激發(fā)波長進行掃描時，首先將發(fā)射波長設(shè)置為530nm，激發(fā)波長從360nm至500nm 且每隔2nm步進。當確定最佳發(fā)射波長進行掃描時，首先激發(fā)波長設(shè)置為440nm，發(fā)射波長從470nm至600nm且每隔2nm步進。圖一中顯示出當EGFP的發(fā)射峰在506nm（GFP）附近，即512nm(EGFP；圖一)時，其激發(fā)峰從394nm紅移至482nm。
GFP和EGFP采用Tune技術(shù)（圖一）
使用SpectraMax Paradigm微孔板檢測平臺和Tune技術(shù)在SoftMax Pro6軟件光譜掃描模式下獲得GFP和EGFP的光譜。我們從光譜中明顯發(fā)現(xiàn)它們的激發(fā)峰的最大值發(fā)生移動，藍色線代表GFP光譜，綠色線代表EGFP光譜，虛線代表激發(fā)光譜，實線代表發(fā)射光譜
光譜優(yōu)化向?qū)Чδ?/SPAN>
使用SoftMax Pro6軟件中的光譜優(yōu)化向?qū)Чδ軄泶_定GFP和EGFP的最優(yōu)波長，用戶可以選擇激發(fā)和發(fā)射波長掃描范圍，同時也可確定波長步進度。光譜優(yōu)化向?qū)軌蛲瑫r掃描激發(fā)和發(fā)射波長，并計算每一對激發(fā)/發(fā)射波的信號與背景的比值，計算方法的公式為（信號-背景）/背景。結(jié)果以熱圖形式顯示出一對激發(fā)/發(fā)射波長，十字圖標中心的位置顯示出了最高信號與背景比值，圖二為GFP掃描結(jié)果。
優(yōu)化激發(fā)與發(fā)射波長（圖二）
光譜優(yōu)化向?qū)У慕Y(jié)果可以通過熱圖的形式顯示出來，給出了GFP熒光染料分子的最佳激發(fā)和發(fā)射波長，顯示GFP優(yōu)化后其最佳激發(fā)波長405nm、發(fā)射波長510nm，EGFP的最佳激發(fā)波長465nm、發(fā)射波長515nm(未顯示)
通過表一的數(shù)據(jù)可以發(fā)現(xiàn)，使用波長優(yōu)化向?qū)Чδ芎筇岣吡?/SPAN>GFP的各種突變體檢測靈敏度。GFP激發(fā)波峰與發(fā)射波峰相距112nm，靈敏度的提高得益于波長優(yōu)化后適度改變了激發(fā)和發(fā)射波峰，然而EGFP激發(fā)波峰與發(fā)射波峰僅相距30nm，通過光譜優(yōu)化向?qū)Чδ苡嬎愫罂傻贸鲎罴巡ㄩL可以使得檢測靈敏度提高80倍，優(yōu)化后激發(fā)和發(fā)射波峰相距50nm，降低了的激發(fā)光干擾。
表一：分別通過Tune卡盒優(yōu)化波長或固定激發(fā)和發(fā)射波峰，比較兩種方法針對GFP和EGFP兩種染料分子的檢測下線（LLDs）
結(jié)論
當用戶面對全新未知的熒光染料分子進行波長優(yōu)化時，如果通過Tune卡盒的光譜優(yōu)化向?qū)Чδ懿粌H可以自動優(yōu)化出該染料分子的最佳激發(fā)和發(fā)射波長并可以減少50%的時間。激發(fā)波長范圍360nm至790nm，發(fā)射波長范圍400nm至850nm，SpectraMax Paradigm微孔板檢測平臺加上Tune卡盒后，能夠檢測絕大多數(shù)常用的熒光染料分子，并且檢測靈敏度較傳統(tǒng)光柵型系統(tǒng)高出10倍以上。如上述試驗所示，當使用的熒光染料分子(如EGFP)的斯托克位移較窄時，通過Tune卡盒波長優(yōu)化功能可大幅度提高試驗檢測的靈敏度（提高80倍）。 Tune 卡盒除具有熒光強度檢測模式外，也提供了時間分辨熒光和化學(xué)發(fā)光的檢測模式，增加了試驗檢測方法的多樣性。
