高通量細胞遷移篩選

    細胞遷移是一個活的生物生長和維持生命過程中不可缺少的的關鍵過程。為了完成相應的功能，體內的細胞經常會以特定的方向遷移到特定的位置。遷移是一個循環的過程，細胞向前端伸出突觸，縮回其尾端。動物組織中的細胞發生遷移主要是為了響應特定的外部信號。

    細胞遷移對于胚胎發育、傷口愈合、分化以及免疫應答等都是非常重要的過程。細胞遷移是血管疾病，慢性炎癥疾病以及腫瘤形成等疾病的致病機理。因此，對那些具有促進（傷口愈合）或者抑制（腫瘤形成）細胞遷移作用的化合物的研究就具有非常重要的治療意義。我們已經建立了一個使用Molecular Devices公司的SpectraMax paradigm多功能檢測平臺進行標準化的，自動化的高通量細胞遷移分析新方法。相對于劃痕分析或者其他的2D傷口閉合實驗，這個分析方法更加簡單，更具可重復性。

試驗描述

    Oris細胞遷移試驗（non-coated）（Platypus Technologies，Madison，WI）使用細胞種植抑制板（cell seeding stoppers）在每個孔的中央形成2mm直徑的檢測區域。人黑色素瘤細胞（50000每孔）被種植到安裝有細胞種植抑制板的96微孔板。過夜培養后，細胞貼附到微孔板板底，在抑制板的作用下，形成中央2mm的細胞空白區域。移走抑制板，然后對細胞不做處理或者使用可溶性的趨化因子CXCL9以濃度依賴的方式處理，或者使用100ng/ml不同生物活性的化合物或者latrunculin（1ug）作為陰性對照進行處理。然后，黑色素瘤細胞繼續培養16個小時。使用CellTracker Green（Invitrogen）對細胞染色，微孔板的底部加入Oris檢測屏蔽（Detection Mask）（圖1）。發生細胞遷移進入檢測區域的細胞使用共聚焦顯微鏡（Leica TCS SP2）進行成像，數據使用SpectraMax paradigm檢測平臺進行定量確證（圖2）。

圖1：Oris細胞遷移試驗原理

圖2：Paradigm檢測平臺

圖3：篩選潛在的細胞遷移刺激或者抑制因子。通過使用SpectraMax Paradigm檢測平臺讀取Oris細胞遷移（微孔板底貼附有檢測屏蔽——detection mask）的熒光強度來檢測黑色素瘤細胞遷移的程度。試驗做三個復孔。

結果

    為了研究和評估新分離的活性化合物的遷移效應，我們使用人黑色素瘤細胞，使用不同的潛在遷移刺激或者抑制因子進行處理（趨化因子CXCL9，Latrunculin和活性化合物）。我們通過檢測16小時后的熒光強度（終點法檢測）來評估細胞遷移進入檢測區域的程度。圖3總結了化合物的黑色素瘤細胞遷移效應篩選結果。CXCL9顯示出劑量依賴性的檢測區域熒光強度增加（發生遷移的細胞），而Latrunculin沒有遷移效應。盡管許多活性化合物沒有顯示出或者僅顯示出很低的遷移效應，化合物12和15卻明顯促進黑色素瘤細胞遷移進入檢測區域。倍增誘導水平計算方法：每個孔的熒光強度值（RFU）除以陰性對照的平均RFU值。每個樣品的平均值和SD值也被計算出來。

結論

    這個試驗系統證實了一個有用的工具，可以用于高通量的檢測細胞遷移，高通量的藥物篩選。這個研究將Oris細胞遷移分析和SpectraMax Paradigm檢測平臺聯合，通過檢測熒光強度來對細胞遷移的程度進行定量。這個系統能夠區分多種多樣的細胞遷移刺激因子和抑制因子。

作者：

Christoph Wiesner，Maren Pfluger，Constantin Bujnow，Katrin Eisenberger，Wolfgang Schutt，Andreas Eger and Harald Hundsberger

聯系：

University of Applied Science Krems Krems，Austria

harald.hundsberger@fh-krems.ac.at