全自動高內涵成像分析系統應用

——腫瘤學研究：細胞周期及凋亡全自動分析

 摘要 

        在腫瘤學研究及治療過程中，監控細胞周期及凋亡的狀態是一個非常重要的指標。 與傳統的檢測方法相比，如流式細胞FACS，全自動高內涵成像分析系統可對原位（無需消化懸浮處理）細胞進行全自動成像，并完成單個細胞水平的多參數分析。MetaXpress^TM圖像分析及獲取軟件具有一系列常用且操作簡單的應用分析模塊。AcuityXprss^TM細胞生物學分析軟件可對高內涵成像分析產生的海量數據進行可視化管理及數據挖掘。

        MetaXpress軟件中的細胞周期分析模塊，就是專門為細胞周期及凋亡分析開發的應用模塊[Fig 1]。該模塊采用自適應背景扣除技術（Adaptive Background Correcton^TM, ABC），排除因樣品制備等原因帶來的背景不均勻的問題，準確的將細胞與背景區分開來。該模塊可對簡單的均質DNA染料（如DAPI/Hoechst/PI）染色后的細胞進行細胞周期狀態分析[Fig 2-3]，也可用更準確的有絲分裂和/或凋亡標志物進行分析[Fig 1]。

Fig 1: 細胞周期分析模塊界面

Fig 2. 根據每個細胞內DNA含量-總熒光強度，在2N和4N的雙峰圖中設定閾值，確定G0/G1，S，G2期。

Fig 3. 單色DNA染料標記下，可根據每個細胞內染色體的聚集度-平均熒光強度，設定處于分裂期細胞的閾值，確定處于分裂期的細胞，結合2N/4N參數，進一步確定分裂早期Early M及晚期 Late M。

        下面的實例中，我們將用陽性化合物處理細胞后，分析其對細胞周期及凋亡狀態的影響。我們將用MetaXpress軟件中的細胞周期模塊，展示一個集快速、簡單、靈活性為一體的細胞周期及凋亡分析方法。

材料及方法

樣品制備

1. 前列腺癌Du145細胞以8,000/孔接種于96孔板中。
2. 分別將紫杉醇Taxol和星形孢菌素Staurosporine以一定的濃度梯度處理細胞24小時。
3. 將細胞固定，并分別用Hoechst33342（Invitrogen）、anti-phospho Histone H3ser10 （Upstate）（Texas Red 標記二抗） 和anti-cleaved PARP （Cell Signaling） （FITC標記二抗 ）染色。

圖像獲取

1． 使用ImageXpress Micro高內涵成像儀器，通過MetaXpress軟件自帶標準Protocol，對96孔板分別用10倍平場半復消色差物鏡和20倍平場半復消色差物鏡全自動獲取圖像。

2． 每孔獲取4個視野圖像。

運用細胞周期模塊對獲取的圖像進行分析

1． 選擇標記DNA的圖像：Hoechst 標記細胞核，反映DNA含量及結構。

2． 設定細胞核的大小范圍及與背景熒光強度對比值。

3． 設定分裂期細胞參數：通過染色標記的DNA強度界定或有絲分裂標志物（anti-phospho Histone H3ser10）界定。

4． 通過凋亡標記物（anti-cleaved PARP）設定處于凋亡狀態的細胞。

5． 預覽分析結果，互動方式調整分析參數。

6． 對所有圖像進行自動化分析。

數據處理

1． 分析數據導入Excel軟件中進行分析。

2． 運用高內涵生物信息學軟件AcuityXpress對數據進行挖掘，包括曲線擬合、IC50/EC50計算及Hit selection等。

Fig 4. 運用細胞周期模塊進行圖像分析，根據DNA含量及結構對細胞所處的周期狀態進行分析。分析結果圖像與原始圖片對比圖： a) 20X  原始圖片， b) 20X 分析圖片， c) 10X原始圖片， d) 10X分析圖片。

Fig 5. 在10倍和20倍物鏡獲取或不同染色標記分析的情況下，藥物處理之后的藥效結果一致。DNA Avg. Intensity 或 DD 表示運用DNA平均熒光強度界定分裂期細胞。H3s10表示用特異性分裂期標志物 （anti-phospho Histone H3ser10）界定分裂期細胞。 A 表示凋亡Apoptosis， M 表示分裂mitosis。

結論

1． 細胞周期分析模塊可進行準確的細胞核及細胞狀態分析

2． 細胞周期分析模塊參數設置簡單、操作方面、可通過柱型圖和散點圖互動調節參數。

3． 用10倍和20倍物鏡獲得的最終數據，其分析結果一致。

4． 分別運用DNA熒光強度定義分裂期細胞與分裂期特異性標志物定義分裂期細胞，兩種方法分析結果一致。