免疫熒光技術的實驗方法及其分類

一、免疫標記法及其分類

1.熒光免疫法

原理是應用一對單克隆抗體的夾心法。底物用磷酸-4-甲基傘形酮，檢測產物發出的熒光，熒光強度與Mb濃度呈正比，可在8min內得出結果。結果以Mb每小時釋放的速率表示(△Mb)表示。該法重復性好，線性范圍寬，具有快速、敏感、準確的特點。

以雙抗夾心法為例，首先將特異性抗體與固相載體連接，形成固相抗體。除去未結合抗體，然后加受檢標本，使其中的蛋白抗原與固相抗體形成抗原抗體復合物。洗滌除去未結合物，接著加入熒光標記的抗體，使之與抗原特異性結合，形成抗體—抗原—抗體復合物。最后根據熒光強度，即可對蛋白抗原進行定量。

傳統的熒光免疫法受本底熒光的干擾較大，時間分辨熒光免疫測定法是以具有特長壽命的稀土金屬如銪，作為標記物，加入正常液后激發測定，能有效去除短壽命本底熒光的干擾。

2.放射免疫法

放射免疫法是以過量的未標記抗原與放射性物質標記的抗原，競爭性地與抗體結合，形成有放射性的抗原—抗體復合物與無放射性的抗原—抗體復合物，并有過剩的標記抗原與未標記的抗原。然后通過離心沉淀等方法，將抗原—抗體復合物與游離抗原分離，分別測定其放射性強度與標準曲線比較，即可對未標記的待測抗原進行定量。

RIA法測定血清蛋白靈敏度高、特異性強，可準確定量到ng／ml水平。但早期的方法操作麻煩，耗時長，且有放射性污染。近年來，隨著單克隆抗體的應用，RIA的靈敏度又有了較大提高，且操作大為簡化，并已有商品試劑盒供應，使用方便。

3.酶聯免疫法(ELISA)

ELISA法有競爭法和夾心法兩種。競爭法是基于標準或血清Mb和微孑L板上包被的Mb競爭性地與單克隆抗體相結合的原理而建立，該法的最低檢測限為10μg／L，線性范圍達1 000ug／L。夾心ELISA法與EIA具有良好的相關性(r＝0.92)。ELISA法具有靈敏度高，特異性強，精密度好，操作簡單，適用于多份標本的檢測，不需特殊儀器設備等優點，易于推廣普及。但不適合急診的快速檢測。

以雙抗法為例。首先包被抗原，然后加入一抗，使一抗與包被抗原形成抗原—抗體復合物。接著加入酶標二抗，形成抗原—抗體—抗體復合物。最后加入底物，由酶催化底物生成產物。通過產物的生成量即可對蛋白抗原進行定量。

4.偶聯生物素—親和素系統的酶免法

利用了一個親和素分子可以與4個生物素分子結合的特性，使傳統的靈敏度較高的酶免法的靈敏度又有明顯的放大作用。

5.時間分辨熒光免疫分析

時間分辨熒光免疫分析（Time resolved Fluor immunoassay，TRFIA）是一種非同位素免疫分析技術，它用鑭系元素標記抗原或抗體，根據鑭系元素螯合物的發光特點，用時間分辨技術測量熒光，同時檢測波長和時間兩個參數進行信號分辨，可有效地排除非特異熒光的干擾，極大地提高了分析靈敏度。

6.解離增強鑭系元素熒光免疫分析

解離增強鑭系元素熒光免疫分析（Dissociation Enhanced Lanthanide Fluor immunoassay DELFIA）是時間分辨熒光免疫分析中的一種。它用具有雙功能基團結構的螯合劑，使其一端與銪（Eu）連接，另一端與抗體/抗原分子上的自由氨基連接，形成EU標記的抗體/抗原，經過免疫反應之后生成免疫復合物。由于這種復合物在水中的熒光強度非常弱，因此加入一種增強劑，使Eu3 從復合物上解離下來，自由Eu3 同增強劑中的另一種螯合劑螯合形成一種膠態分子團，這種分子團在紫外光的激發下能發出很強的熒光，信號增強了百萬倍。因為這種分析方法使用了解離增強步驟，因此稱為解離增強鑭系元素熒光免疫分析。

二、熒光抗體染色方法及其分類

1.直接染色法

將標記的特異熒光抗體直接加在抗原標本上，經一定溫度和時間的染色，洗去未參加反應的多余熒光抗體，在熒光顯微鏡下便可見到被檢抗原與熒光抗體形成的特異性結合物而發出的熒光。直接染色法的優點是：特異性高，操作簡便，比較快速。缺點是：一種標記抗體只能檢查一種抗原，敏感性較差。直接法應設陰、陽性標本對照，抑制試驗對照。

2.間接染色法

如果檢查未知抗原，先用已知未標記的特異抗體（第一抗體）與抗原標本進行反應，作用一定時間后，洗去未反應的抗體，再用標記的抗抗體即抗球蛋白抗體（第二抗體）與抗原標本反應，如果第一步中的抗原抗體互相發生了反應，則抗體被固定或與熒光素標記的抗抗體結合，形成抗原-抗體-抗抗體復合物，再洗去未反應的標記抗抗體，在熒光顯微鏡下可見熒光。在間接染色法中，第一步使用的未用熒光素標記的抗體起著雙重作用，對抗原來說起抗體的作用，對第二步的抗抗體又起抗原作用。如果檢查未知抗體則抗原標本為已知的待檢血清為第一抗體，基他步驟和檢查抗原相同。

由于免疫球蛋白有種屬特異性，因此標記的抗球蛋白抗體必須用第一抗體同種的動物血清球蛋白免疫其他動物來制備。

間接染色法的優點是既能檢查未知抗原，也能檢查求知抗體；用一種標記的抗球蛋白抗體，能與在種屬上相同的所有動物的抗體結合，檢查各種未知抗原或抗體，敏感性高。缺點是：由于參加反應的因素較多，受干擾的可能性也較大，判定結果有時較難，操作繁瑣，對照較多，時間長。間接法應設陰、陽性標本對照，還應設有中間層對照（即中間層加陰性血清代替陽性血清）。

3.抗補體染色法

抗補體染色法簡稱補體法，是間接染色法的一種改良法，首先由Goldwasser等建立。本法利用補體結合反應的原理，用熒光素標記抗補體抗體，鑒定未知抗原或未知抗體（待檢血清）。染色程序也分二步：先將未標記的抗體和補體加在抗原標本上，使其發生反應，水洗，然后再加標記的抗補體抗體。如果第一步中抗原抗體發生反應，形成復合物，則補體便被抗原抗體復合物結合，第二步加入的熒光素標記的抗補體抗體便與補體發生特異性反應，使之形成抗原-抗體-補體-抗補體抗體復合物，發出熒光。

抗補體染色法具有和間接法相同的優點，此外，還有其獨特的優點：即只需要一種標記抗補體抗體，便能檢測各種抗原-抗體系統。因為補體的作用沒有特異性，它可以與任何哺乳動物的抗原-抗體系統發生反應。它的缺點是參與反應的成分多，染色程序較復雜，比較麻煩。

除上述三種方法外，還有在此基礎上演變出的一些方法，如雙層法、夾心法、混合法、三層法、抗體-抗補體法等等。