本實驗采用雙抗體夾心 ABC-ELISA法。用抗人 HSP27 單抗包被于酶標板上，標準品和樣品中的 HSP27與單抗結(jié)合，加入生物素化的抗人HSP27，形成免疫復(fù)合物連接在板上，辣根過氧化物酶標記的Streptavidin與生物素結(jié)合，加入底物工作液顯藍色，最后加終止液硫酸，在450nm處測OD值，HSP27濃度與OD值成正比，可通過繪制標準曲線求出標本中HSP27濃度。

1.          收集標本：血清、血漿（EDTA）、細胞培養(yǎng)上清液、組織勻漿等裂解產(chǎn)物盡早檢測，2-8℃保存48小時；更長時間須冷凍（-20 ℃或-70 ℃）保存，避免反復(fù)凍融。血清、血漿作1：10稀釋（取20ul，加標本稀釋液180ul,稀釋10倍）。尿液2倍稀釋(取100ul，加標本稀釋液100ul,稀釋2倍)后檢測。細胞培養(yǎng)上清可以不做稀釋直接檢測。

2.          標準品液配制：使用前加入2ml蒸餾水混勻，配成80ng/ml的溶液。設(shè)標準管8管，第一管加標本稀釋液900ul，第二至第八管加入標本稀釋液500ul。在第一管中加入80ng/ml的標準品溶液100ul混勻后用加樣器吸出500ul，移至第二管。如此反復(fù)作對倍稀釋，從第七管中吸出500ul棄去。第八管為空白對照。

3.          10×標本稀釋液用蒸餾水作1:10倍稀釋（示例：1ml濃稀釋液+9ml蒸餾水）。

4.         洗滌液：用重蒸水1:20稀釋（示例：1ml濃縮洗滌液加入19ml的重蒸水）

1.          加樣：每孔各加入標準品或待測樣品100ul，將反應(yīng)板充分混勻后置37℃120分鐘。

2.          洗板：用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌4-6次，向濾紙上印干。

3.          每孔中加入第一抗體工作液100ul。將反應(yīng)板充分混勻后置37℃60分鐘。

4.          洗板：同前。

5.          每孔加酶標抗體工作液100ul。將反應(yīng)板置37℃30分鐘。

6.          洗板：同前。

7.          每孔加入底物工作液100ul，置37 ℃暗處反應(yīng)15分鐘。

8.          每孔加入100ul終止液混勻。

9.          30分鐘內(nèi)用酶標儀在450nm處測吸光值。

1.          所有OD值都應(yīng)減除空白值后再行計算。

2.          以標準品8000、4000、2000、1000、500、250、125、0 pg/ml為橫坐標，OD值為縱坐標，在坐標紙上作圖，畫出標準曲線。

3.          根據(jù)樣品OD值在該曲線圖上查出相應(yīng)HSP27含量，再乘上稀釋倍數(shù)即可。

             1.   靈敏度：最小的HSP27 檢測濃度小于65pg/ml。

2.        特異性：可同時檢測重組或天然的人HSP27。不與人其它細胞因子有交叉反應(yīng)。

3.        重復(fù)性：板內(nèi)、板見變異系數(shù)均小于12％。

             1.   以上標準孔及待測樣品均建議做復(fù)孔，每次測定應(yīng)同時做標準曲線。

 2.   洗滌過程很關(guān)鍵。洗滌不充分將導(dǎo)致精確度誤差及OD值錯誤地升高。

             3.   板條開封后剩余板條要再封好，保持板條干燥。

             4.   本試劑盒宜置4^oC冰箱保存。

 5.   本試劑盒僅用于科研，不能用于臨床診斷！