德克薩斯A&M大學（TAMU）Jean-Phillipe Pellois博士研究組的興趣在于理解多肽如何溶解或者跨過生物膜，以及運用這方面的知識開發能夠使蛋白滲透細胞的試劑。能夠使蛋白滲透到細胞在醫學或者細胞生物學上有很大潛在用途，這樣做最有吸引力的方法包括把蛋白吸附到類似于細胞穿膜肽（CPP）這樣的載體系統上。CPPs是一種攜帶大分子載體運輸到細胞內的多肽，其原型例子包括一種來源于HIV的多肽TAT(GRKKRRQRRR)。CPP-蛋白偶合物分兩步穿入細胞。首先，CPP-蛋白偶合物通過胞噬作用進入細胞，這些分子位于細胞內，但是被捕獲在內涵體內 (Fig 1A)。然后這些分子從內涵體釋放出來，CPP-蛋白偶合物逃離內涵體并進入細胞的胞質空間。

 

關于內涵體釋放蛋白的機制了解不多。而且，該過程效率非常低。這代表了一個主要瓶頸，因為蛋白未從內涵體成功逃離將不產生生物反應。為了提高效率并且使蛋白能容易地傳遞到細胞，Pellois實驗室正研究幾個促進內涵體釋放策略。問題是要使內涵體的膜溶解而不引起其它細胞的膜破裂，因為這樣會導致細胞死亡。

 

 

一種溶解內涵體而不溶解其它膜的方法包括采用依賴pH值的具有溶解作用的多肽。這是基于內涵體腔為酸性(pH 4.5-6.5)，這提供了細胞內特殊的化學環境。例如，多肽E5(GLFEAIAEFIENGWEGLIEGWYG)是流感HA2融合肽的類似物，該研究組考慮E5能否作為融合物促進重組蛋白的傳遞。他們檢測到在酸性pH下E5質子化并結合到脂質雙層。然后，形成孔結合處足夠大可讓大蛋白通過膜擴散[Ref 1]。為了研究這些多肽在細胞內的活動，該研究組采用熒光蛋白E5-TAT-mCherry作為模型，在該系統中，E5用于溶解內涵體，TAT用于蛋白內噬作用，mCherry提供熒光信號，以便在熒光顯微鏡下觀測。

 

 Pellois研究組發現，當E5-TAT-mCherry同活細胞孵育時，它能夠溶解內涵體，但是即使在溶解發生后，E5使E5-TAT-mCherry仍然與內涵體相聯。一種可能的解釋是，E5仍然不可逆地結合到內涵體膜上，雖然E5導致了內涵體溶解，但阻止了蛋白釋放。受這些結果鼓舞， Pellois研究組還顯示能夠通過與E5-TAT傳遞大分子，這適用于組織培養檢測(Fig 1B) [Ref 2]。E5-TAT能夠使細胞吸入其周圍含大分子的培養基。因此，E5-TAT和共孵育的大分子能夠共同聚集到內涵體。一旦內涵體酸化，E5-TAT導致了內涵體溶解，位于內涵體腔的大分子自由逃逸到細胞質空間并發揮其生物功能。

 

 

要改進CPPs內涵體溶解活性的想法是創新多價系統來增加在內涵體膜上局部濃度。Pellois研究組探索了通過合成多個TAT拷貝(TATn, n = 2, 3, 4, 5 ,6 ) 的分支狀分子的方法[Ref 3]。類似于TAT，TAT2進入內涵體，不能溶解內涵體。TAT4、TAT5、TAT6都不能改進大分子傳遞，因為這些化合物結合到細胞質膜上不活躍。相比之下，TAT3是獨特的，因為，該構造能夠溶解內涵體并比其它多聚體類似物更有效地把大分子傳遞到細胞質膜(Fig 1C)。目前，他們正研究TAT3在分子水平上能否使內涵體膜溶解以及TAT自身如何行使其自身功能的。

 

 

用溶解內涵體的第三個有吸引力的方法用可見光激發內涵體里存在的TAT熒光復合物。Pellois研究組證明用TMR（tetramethylrhodamine，四甲基羅丹明）標記TAT的TMR-TAT在照射后幾秒內能夠溶解內涵體(Fig 2)。該作用是根據一旦激發TMR，膜上就產生活性單個游離重態氧分子[Ref 4]。他們的模型是多肽把附近的熒光素帶到膜上，雖然熒光素當時不產生單個游離態氧，但是它局部導致膜組分輕易破壞。該方法是有趣的，因為它可能產生了一種方法學，研究者可采用該方法對傳遞事件在時間和空間上進行控制，允許他們實時研究某個既定分子在胞內濃度突然增加的作用。

 

 

 

許多問題仍需要解決：這些試劑在分子水平上是如何溶解膜的？在胞吞途經運輸時被傳遞的大分子降解嗎？溶解內涵體的生理作用是什么？解決這些問題來使內涵體溶解試劑活性達到最優傳遞條件。Pellois研究組目前也試驗他們的方法用于對把轉錄因子傳遞到細胞內。現在的目標是重新編程和操作人類細胞以獲得組織修復。最后，他們正采用從內涵體裂解獲得教訓來開發能有效裂解細菌膜的多肽試劑。這一方面，目的是學會如何殺死細菌而不殺死人的健康細胞。

 

1. Lee, Y. J.; Johnson, G.; Pellois, J. P. Biochemistry 2010, 49, 7854.

2. Lee, Y. J.; Erazo-Oliveras, A.; Pellois, J. P. Chembiochem 2010, 11, 325.

3. Angeles-Boza, A. M.; Erazo-Oliveras, A.; Lee, Y. J.; Pellois, J. P. Bioconjug Chem 2010, 21, 2164.

4. Srinivasan, D.; Muthukrishnan, N.; Johnson, G. A.; Erazo-Oliveras, A.; Lim, J.; Simanek, E. E.; Pellois, J. P. PLoS ONE 2011, 6, e17732.