脈沖瞬態葉綠素熒光儀的研發

郝建卿¹ 白瑜² 張榮² 鄭彩霞¹ 高榮孚¹

1．北京林業大學 生物科學與技術學院植物生理教研組 2．北京雅欣理儀科技有限公司

     Schreiber(2004)和 Strasser(2004)的文章代表當前葉綠素熒光儀的主流方向，Walz公司的PAM調制型熒光儀在1986年推出后深受廣大研究者歡迎，成為研究葉綠素熒光動力學主流。隨后其他一些公司，也陸續推出相應的儀器。非調制的瞬態熒光儀由于電子元件器件和單片機數據采集器等的發展，克服了F₀測定問題，在1990年后，以Hansa公司的PEA及有關新的型號為主，順應了在光抑制和非還原中心的相關研究需要。

     近些年來，瞬態熒光技術得到了較大的發展，特別是OJIP（或OKJIP）及其他相關的研究（Stasser 2001）。最近更由于熒光動力學模型及相關模擬技術的發展，主要以瞬態熒光為基礎的（Laisk 等主編Photosynthesis in silico）模擬技術，更使瞬態熒光儀有了新的發展。但是調制熒光儀以F₀、F_m、F_m'、F₀'和F_s等基本參數為基礎可以計算多種熒光動力學參數，仍是當前葉綠素熒光動力學研究的主要內容。同時我們從2005年開始，研究后穩態誘導熒光動力學，有可能進一步發展在后穩態條件下的相關參數。鑒于非調制的瞬態熒光儀相對較簡單，結合調制型的飽和脈沖技術，開發了脈沖瞬態熒光儀（Pulse Transition-Fluorescence Meter，商品名Yaxin-1161G葉綠素熒光儀），具有瞬態熒光儀特征（能測定OJIP及其他參數），同時結合調制型熒光的優點（能測F₀、F_m、F_m'、F₀'和F_s等基本相關參數），這樣達到便攜和小型化。

 

    一、儀器相關參數

 飽和脈沖光強強度范圍：0-5000 µmol ·photon ·m^-2s^-1

 光化光光強強度范圍：0-2000µmol ·photon ·m^-2s^-1

 采樣速率5µs 可變

 A/D 12位

    二、測定結果

    1．  典型瞬態模式測定

   該模式下，可得到典型的OJIP的數據，觀察到不同光化光強度條件下的OJIP曲線及其相關參數，如圖1所示。

圖1 不同光化光強度條件下的OJIP曲線

注1：盆栽綠蘿放入暗室，暗適應2h后測定不同光化光強度下OJIP的變化。如上圖所示，測定強度從上到下一次為3500、3000、2500、2500、2000、1500、1000、500、200、100和50µmol ·photon ·m^-2s^-1等，光化光持續時間均為10s。

 

                                              表1  不同光化光強度條件下測得的相應的參數

測量項目	AL(T)	Total Time /s	F0	Fm	Fv/Fm
OJIP	50(10)	10	7	12	0.42
OJIP	100(10)	10	9	31	0.71
OJIP	200(10)	10	16	81	0.8
OJIP	500(10)	10	39	203	0.81
OJIP	1000(10)	10	76	417	0.82
OJIP	1500(10)	10	113	582	0.81
OJIP	2000(10)	10	149	775	0.81
OJIP	2500(10)	10	167	971	0.83
OJIP	3000(10)	10	214	1124	0.81
OJIP	3500(10)	10	253	1423	0.82

 

     2．脈沖瞬態熒光動力學測定

      該模式下可得F₀、F_m、F_m'、F₀'和F_s五項參數，用于類似調制式熒光儀相關參數的計算。同時可以獲得從暗適應后第一個飽和脈沖的到的OJIP圖形，還能得到第2個脈沖及以后各個脈沖相關變化，即J和P的相關變化。如圖2所示。

                圖2 脈沖瞬態不同光化光強度條件下OJIP曲線

 

 

注：盆栽綠蘿放入暗室，暗適應2h后進行不同光化光強度下，脈沖瞬態熒光動力學的測量。如上圖所示，測定強度依次為50、100、500和1800。測量過程中，飽和脈沖強度設為5000，設置光化光梯度，測量時間為儀器本身設置，飽和光1s，光化光9s，共10s，設置測量時間為300s。300s測量時間結束，開始施加遠紅光時長4s，黑暗時長1s，接著有個短的飽和脈沖出現獲取F₀^'后，整個測量結束。

 

                                               表2 脈沖瞬態熒光動力學測定所得的相關參數

測量 項目	SL(T)	AL (T)	Total Time/S	FR T/S	Dark T/s	F0	Fm	Fv/Fm	F0'	Fm'	Fs	qP	qN	ΦPSII
脈沖瞬態	5000(1)	50(9)	300	4	1	319	1536	0.79	303	1190	474	0.807	0.271	0.602
脈沖瞬態	5000(1)	100(9)	300	4	1	273	1462	0.81	271	973	485	0.695	0.41	0.502
脈沖瞬態	5000(1)	200(9)	300	4	1	361	2197	0.84	354	997	585	0.641	0.65	0.413
脈沖瞬態	5000(1)	300(9)	300	4	1	383	1928	0.8	360	1015	604	0.627	0.576	0.405
脈沖瞬態	5000(1)	500(9)	300	4	1	345	2161	0.84	347	914	593	0.566	0.688	0.351
脈沖瞬態	5000(1)	800(9)	300	4	1	355	2100	0.83	306	677	530	0.396	0.787	0.217
脈沖瞬態	5000(1)	800(9)	300	4	1	348	2205	0.84	294	601	525	0.248	0.835	0.126
脈沖瞬態	5000(1)	1000(9)	300	4	1	342	2181	0.84	308	678	595	0.224	0.799	0.122
脈沖瞬態	5000(1)	1500(9)	300	4	1	324	1819	0.82	285	542	492	0.195	0.828	0.092
脈沖瞬態	5000(1)	1800(9)	300	4	1	316	1907	0.83	270	525	487	0.149	0.84	0.072
脈沖瞬態	5000(1)	2000(9)	300	4	1	304	1880	0.84	268	509	478	0.129	0.847	0.061

 

    3．后穩態誘導熒光動力學測定

     達到穩態后，由于接著再給飽和脈沖、黑暗以及遠紅光的誘導，所以在光化光誘導下可產生后穩態誘導熒光動力學。如圖3 所示。

                      圖3后穩態不同光化光強度條件下OJIP曲線

   

   

注：盆栽綠蘿放入暗室，暗適應2h后進行不同光化光強度下，后穩態熒光動力學的測量。如上圖所示，測定強度依次為50、100、500和1800。測量過程中，飽和脈沖強度設為5000，設置光化光梯度，測量時間為儀器本身設置，飽和光1s，光化光10s，共11s。第一個飽和光之前葉片暗適應，然后開始測量，發出第一個飽和光，飽和光完成后，施加遠紅光（4s）、黑暗(1s)、光化光(10s)，然后又是一個飽和光，這樣就完成了2次測量，即2個飽和光出現過了。本次實驗設置了20次測量，整個測量過程中飽和光會出現20次，這20個飽和光中間，隔著遠紅光、黑暗和光化光，最后一個飽和光完成后，測量結束。     

                        表3 后穩態熒光動力學測定所得的相關參數

測量項目	SL(T)	AL(T)	Total T	FR Time/s	Dark T/s	F0	Fm	Fv/Fm
后穩態	5000(1)	50(10)	20次	4	1	365	1909	0.81
后穩態	5000(1)	100(10)	20次	4	1	356	2296	0.84
后穩態	5000(1)	200(10)	20次	4	1	362	1859	0.81
后穩態	5000(1)	500(10)	20次	4	1	352	2024	0.83
后穩態	5000(1)	800(10)	20次	4	1	382	1925	0.8
后穩態	5000(1)	1000(10)	20次	4	1	372	1918	0.81
后穩態	5000(1)	1200(10)	20次	4	1	357	1908	0.81
后穩態	5000(1)	1200(10)	20次	4	1	338	1750	0.81
后穩態	5000(1)	1800(10)	20次	4	1	325	1649	0.8
后穩態	5000(1)	2000(10)	20次	4	1	246	1412	0.83

 

    4．循環電子傳遞和線性電子傳遞相關性的測定

     穩態熒光后，如果停止光化光，P₆₈₀停止電子輸出，而P₇₀₀在遠紅光繼續傳遞電子，是光合電子進入循環式電子傳遞，大約需10s或更長一段時間后，突然有光化學誘導使P₆₈₀發出電子。在這一過程就可以了解電子的情況。如圖4所示。               

                   圖4  不同遠紅光時長下OJIP曲線

儀器生產商：北京雅欣理儀科技有限公司