RFLP技術在作物育種上的應用與展望
張寶國 劉 騫
(延邊大學農學院，吉林 龍井133400)
(延邊大學農學院，吉林 龍井133400)
摘 要：RFLP是隨著生物技術若干領域的發展而產生的一種分子標記技術, 用該技術可作出 植物的RFLP圖譜，并應用于植物遺傳和育種研究。本文簡單的對RFLP技術的基本原理、技術 步驟及其優缺點作了簡單的概況。
關鍵詞： RFLP；作物研究；應用
中圖分類號： S5．032 文獻標識碼：A 文章編號： 1008-7508（ 2007）03-0105-03
一、基本原理
限制性核酸內切酶（restriction end nuclease）能夠識別DNA雙鏈上特異的堿基序列并能 將之切斷。不同的限制性核酸內切酶有各自特異的識別序列。在同源染色體相應的DNA區段 ，用一種限制性核酸內切酶消化，由于堿基組成不同，就會產生不同長度的酶切片段，然后 用標記好的相應的DNA探針與這些片段雜交，顯示出的圖譜就可以反映出基因組DNA堿基序列 組 成是否存在差異。這一技術的基礎是通過限制性核酸內切酶切片段長度多態性來揭示DNA堿 基序 列組成的異同，因而稱為限制性片段長度多態性（Restriction Fragment Length Polymorp hism，縮寫為RFLP）技術。
二、RFLP技術的基本步驟
這一技術主要包括三大步驟：
1、靶DNA的準備 先將基因組DNA抽提出來，選用合適的限制性核酸內切酶酶解基因組DNA， 將酶解出來的具有各種長度的DNA片段在瓊脂糖凝膠電泳分離，使其按片段的長短排列，將D NA片段變性后轉移至硝酸纖維膜或尼龍膜上，稱印跡（Southernb1ot）轉移，并在80℃烘烤 或用長波紫外線照射，將DNA固定在膜上。
2、核酸探針的標記 將準備作為探針的DNA片段純化（這些DNA片段可以是基因組DNA的 一個片段，或是cDNA，或是人工合成的寡核苷酸），用放射性元素（如α－32p）或非放射 性元素（如Dig－dUTP等）標記，經純化后再用。
3、雜交顯示 將標記好的探針與硝酸纖維膜或尼龍膜上的單鏈核酸雜交，洗膜去除未雜交 的標記探針后，進行放射自顯影或加入酶的底物進行顯色反應，再對顯示出來的譜帶進行分 析。
三、RFLP技術的優點及注意的問題
1、RFLP技術的優點
第一，標記數目可以是無限的：RFLP揭示的是DNA水平自然變異，其數目幾乎是無限的。
第二，大部分標記為共顯性：表現RFLP的位點一般是單一序列，每個位點通常有兩個等位基 因(其顯性)。遵循孟德爾式遺傳，因而RFLP標記圖也可用傳統的基因標圖方法來構建。
第三，任何生育期都可預測，不受環境影響：DNA分子水平標記沒有發育階段或器官的特異 性，不受環境條件及基因互作的影響。
第四，高度變異性：每一植株都會有大量的多態性。通常只要有一次有性雜交，一個作圖群 體就能構建一個較豐富的RFLP圖譜。
2、在做RFLP分析技術時，有幾個問題是需要引起密切注意：
第一，作為檢測對象的DNA分子必須保持大分子，在抽提DNA的過程中避免人為地將DNA分子 機械性切割成小片段的DNA，否則最終顯示的RFLP圖譜可能是一種假象；
第二，在用限制性內切酶消化大分子DNA時，要使DNA被完全消化，否則所得的結果也不可靠 ；
第三，被消化的DNA濃度不能太高；
第四，電泳時要用低壓電泳；
第五，雜交前探針必須充分變性；
第六，要根據探針標記的情況以及探針與靶DNA間序列互補的程度和G、C的含量來掌握雜交 和洗膜的條件；
第七，作放射自顯影時，要根據雜交后膜上的放射活性等因素決定曝光的時間。
四、RFLP在作物遺傳育種上的應用
1、分子水平上選擇目的性狀
RFLP圖本身對植物育種并沒有直接的用處，只有當它與經典標記即原已定位的基因結合起來 才有用，當確定哪一個RFLP標記與目的性狀表現協同分離，即目的基因與RFLP的連鎖，使得 對期望基因重組型的選擇容易進行，在分子水平上選擇目的性狀，不受環境條件遺傳背景的 影響，RFLP連鎖圖譜為育種者們提供了一種高效選擇手段，在馬鈴薯、玉米、辣椒、棉花、 大豆、生菜、甘薯、番茄、麥類作物上已相繼出現RFLP作圖的有關報道。育種者們只要選擇 了與目的基因緊密連鎖的一個或多個RFLP標記，也就選擇了目的基因，因為與目的基因連鎖 的RFLP標記是易于檢測的。這種間接對那些直接選擇有困難或過于費時、費力的性狀以及在 分離群體中隱性性狀的選擇特別有效。在番茄中已鑒定的與RFLP標記連鎖的基因，有番茄花 葉病毒、鐮刀菌、細菌斑和根結線蟲的抗性基因及控制植株生長習性(SP)和果實成熟特性的 主效基因，另外玉米中矮桿花葉病毒抗性基因、萵苣霜霉病抗性基因也都建立了RFLP標記。
2、RFLP遺傳標記與作物數量性狀基因定位
在農作物中有許多經濟性狀都是由單個基因效應微小的多基因控制且易受環境影響的數量性 狀，多年來對這類性狀的遺傳研究主要采用數量遺傳學的方法，通過適當的試驗設計和統計 模型估算出平均數、方差、協方差、遺傳力、配合力等遺傳參數．用這些參數描述群體的遺 傳特征，對育種研究起了一定的指導作用，但對控制數量性狀的基因數目、數量性狀基因座 位(Quantitative Trait Loci簡稱QTL)在染色體上的位量，QTL各基因座位對數量性狀的貢 獻大小及其基因間關系等問題，則需RFLP檢測技術來研究。目前用高密度RFLP圖譜上的分子 標記作為重要數量性狀，如產量、株高、果實及種子成分含量等QTL作圖，可望推出控制數 量性狀的多基因數目，確定QTL在染色體上的位置，測定單個基因的作用效應。應用分子標 記定位QTL的過程是首先檢測、篩選親本并構建遺傳群體，構建分子標記連鎖圖，然后根據 統計模型及方法與QTL的連鎖關系及QTL在染色體上的區域等，達到定位QTL之目的。近年來 ，應用RFLP標記在番茄、玉米、水稻等作物中的QTL定位研究取得了可喜的成果，如水稻稻 瘟 病抗性多基因定位，番茄果重、可溶性固體含量、pH值QTL定位研究，控制玉米成熟性的QTL 分析等。
3、進行品種或品系遺傳純度的測定
對整個基因組中許多連鎖位點上RFLP圖譜的了解，則可對某一品種或純系進行基因型圖解， 以代表這一品系具有品種特異性，因此基因組中一些微小變異可以從RFLP圖譜的改變監測出 來；所以RFLP圖譜技術還可用于種子專利登記中，解決侵權糾紛，在歐洲已為一些商業育種 者用來保護自己的品種權益。
4、改良回交育種技術
有性雜交育種就是將具目的性狀品種與待改良的品種進行雜交，其分離后代的染色體由雙親 的染色體片段鑲嵌而成，即帶有所需的親本性狀，也帶有不希望出現的親本性狀。回交育種 技術引入供體基因后，用以恢復親本原有優良基因型的方法，通過多次回交選擇或回交、自 交選擇(目的基因為隱性)，就能得到遺傳上與受體親本相似，但加入了目的基因的植株。回 交育種局限性在于時間長，目的基因為主效、易檢測，RFLP技術的出現可望克服回交育種的 局限，如欲轉移的基因與RFLP標記緊密連鎖，則在幼苗期，即性狀尚未表達之前就可檢測目 的基因是否存在，并且利用RFLP技術，回交育種也可針對于數量性狀基因進行。
5、建立不相容的作物間的遺傳關系，進行作物間基因組同源性的測定
在分類學上，一些性不相容的作物有一定的親緣關系，如甘蘭、蘿卜、 白菜都屬蕓苔屬， 玉米、高粱都屬禾本科，馬鈴薯、番茄、辣椒等屬茄科，但對它們基因染色體組的同源性所 知甚少，如果染色體成分的基因順序在親緣種間是高度保守的，則有可能通過體細胞雜交或 外緣DNA導入等手段，替換單個染色體或染色體片段，將作物的優良性狀及那些在一個種的 正常雜交范圍內無法得到的基因組合到一起。利用同一套探針進行RFLP作圖，已測定了番茄 、馬鈴薯和辣椒的染色體組成和基因順序的保守程度，建立三者之間的比較連鎖圖譜，通過 比較番茄和馬鈴薯間高度連鎖保守，染色體有部分同源性，有可能進行染色體或片段交換， 而辣椒同源性差。
五、問題與展望
RFLP技術結合到常規育種程序中，使人們能快速精確地獲得、轉移和組合基因。由于RFLP對 育種方法學的直接影響，RFLP探計的應用將可能作為最先列入商業或政府育種計劃的生物技 術之一，也將成為對農業生產影響的第一批生物技術。但RFLP圖譜的可利用程度依賴于其飽 和水平，即片段數目和這些片段在染色組分布水平與所表現出的多態性水平，并且還要求某 一多態性特征與某一期望的表現型相連鎖。RFLP作圖計劃的目標之一是建立“飽和圖”，所 有染色體每隔10～20個交換單位(cM)就有RFLP標記，一個飽和圖要包含150個左右間隔均勻 的標記，即必須用數以百計的探計作圖，才有可能達飽和水平，故而這項技術費用昂貴及放 射性同位素標記存在問題，是目前RFLP技術普遍應用的局限性。但將來發展簡便方法，用生 物素或酶標記的DNA探計，費用將會降低。
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