作者：馮銘 王任直    作者單位：中國醫學科學院-中國協和醫科大學北京協和醫院神經外科， 北京 100730

【摘要】  近年來，干細胞在神經系統疾病、血液病和心臟疾病治療中獲得廣泛應用。干細胞移植后，活體示蹤干細胞的存活和遷徙具有重要意義。分子影像學技術的發展使干細胞活體示蹤成為可能，光學成像、磁共振成像、單光子發射計算機斷層顯像、正電子發射計算機斷層顯像是臨床和實驗中常用的分子影像學方法，具有各自的優勢和缺點。本文即對以上成像方法在干細胞活體示蹤方面的研究進展及應用前景予以綜述。

【關鍵詞】  分子影像學 干細胞移植 熒光抗體技術

　　干細胞是具有自我更新和多向分化潛能的細胞，對腦血管病、神經退行性病、血液病、缺血性心肌病等有著廣闊的應用前景。分子影像學的發展使在活體狀態下示蹤移植細胞的存活、遷徙成為現實。
　　     
　　Weissleder[1]于1999年提出分子影像學概念，即在細胞和分子水平活體評價生物過程，包括體內示蹤細胞的存活、遷徙。目前，分子影像學用于干細胞活體示蹤的技術主要包括光學成像、磁共振成像、核醫學成像，后者主要包括單光子發射計算機斷層顯像 （single photon emission computed tomography，SPECT） 和正電子發射計算機斷層顯像 （positron emission tomography，PET）。

　　1    光學成像
       
　　檢測活體動物體內基因表達及細胞活動的光學成像技術具有操作簡便、直觀性強的優點，其關鍵是設計生物相容性好的近紅外熒光染料，研制特異性影像探針，合成可激發的生物發光蛋白[2]。光學成像包括生物發光成像和熒光成像，前者利用動物體內的自發熒光，不需要激發光源；后者需要外界激發光源。

　　1.1    生物發光成像    生物發光技術采用熒光素酶基因標記干細胞或DNA， 靠酶和底物的特異作用而發光。由于動物體自身不會發光，故生物發光背景極低，從動物體表的信號水平可直接得出發光細胞的數量。Maxwell等[3]用熒光基團結合的氧化鐵納米顆粒標記造血干細胞，進行熒光成像；與流式細胞計數結合，可以評價干細胞標記效率和歸巢能力。Rosen等[4]采用納米熒光探針標記間充質干細胞，植入哺乳動物心臟，結果8周后仍可看到移植細胞。

　　1.2    熒光成像    熒光技術采用熒光報告基因，如綠色熒光蛋白 （GFP） 等熒光染料對干細胞進行標記，報告基因、熒光染料受到激發即可產生熒光。熒光成像的波長范圍為400～900 nm，常見熒光材料具有不同的波長范圍可供選擇[5]。這種技術較生物發光操作簡單，無需注入底物，發光強度高。但生物體內許多物質在受到激發光激發后，會產生較強的自發熒光，以至會嚴重影響檢測的靈敏度，特別是當發光細胞位于組織內部時，背景底色會很高。該技術的主要優點是無輻射，可進行連續、實時監測，靈敏度、分辨率較高，而花費相對較低。光的穿透能力很有限，僅為數毫米到數厘米，因此，熒光成像多用于小動物的實驗研究。另外，由于散射等原因，其空間定位能力較差。

　　2    磁共振成像
       
　　MRI是最常用的成像方法，由于有效成像時間長，可觀察細胞的動態遷徙過程，空間、時間分辨率高，對比度好，因此，其前景看好。
　　     
　　MRI主要依賴縱向 （T1）、橫向 （T2） 弛豫時間及使用對比劑前后弛豫時間的差別來診斷。常用的對比劑有兩種：一種是釓類 （Gd3+），T1WI為高信號，也稱陽性對比劑；另一種為超順磁性對比劑，如SPIO （superpara-maganetic iron oxide） 和USPIO （ultra- small superparamagnetic iron oxide），T2WI和T2*WI （對鐵顆粒敏感） 為明顯的低信號，稱陰性對比劑。Gd3+標記的細胞只能在移植后1周內檢測到，不能用來長期監測細胞的存活及遷徙[6]。而SPIO在體內更穩定，也能提供更好的對比度；居勝紅等[7]采用國產的磁性納米粒子標記人臍血間充質干細胞，獲得了滿意的結果。單純應用SPIO標記干細胞效率較低， 而通過轉染劑可顯著提高標記效率。常用轉染劑包括魚精蛋白 （PRO）、多聚賴氨酸 （PLL）、繁枝體大分子化合物 （Dendrimer） 等；其中以陽離子轉染劑PLL應用最多，其通過電荷吸附作用結合SPIO，可以有效地被內涵體吞噬。菲立磁 （Feridex-PLL） 對間充質干細胞的活力和增殖能力無影響[8]，但可抑制干細胞向軟骨方向分化[9]，而向脂肪和骨方向的分化不受影響。
　　     
　　目前，磁共振可以檢測到很少量的細胞甚至單細胞[10]。Hoehn等[11]采用USPIO標記大鼠胚胎干細胞，植入大鼠腦缺血對側的皮質下及紋狀體，數天后，MRI顯示出移植細胞向缺血區域移行的路徑。魏俊吉等[12]將標記Feridex的人骨髓基質干細胞 （hBMSC） 植入腦缺血大鼠的同側及對側腦實質內，MRI顯示移植后第14天，缺血同側移植組hBMSC向缺血灶邊緣遷移，缺血對側hBMSC沿胼胝體彌散。Ju等[13]采用SPIO標記鼠BMSC，植入鼠肝損害模型，MRI可活體觀察到移植細胞，組織學檢查證實肝臟內有存活的BMSC。
　　     
　　用SPIO標記干細胞具有許多優勢：信號對比度好，尤其在T2WI和T2*WI；對比劑由可生物降解的鐵組成，分解后參與鐵代謝，可被機體再利用；核心層外包被葡聚糖，可直接結合各種功能性基團；很容易用光鏡或電鏡觀察到；通過改變顆粒的大小，可以調整其磁效應。但SPIO的應用也有一些限制：鐵顆粒會引起信號的丟失，產生所謂的黑洞效應，直接影響MRI相關解剖結構的顯示，不能區分移植細胞和人工植入物造成的磁敏感性偽影；細胞所攜帶的非遺傳物質會逐漸減少，被排出細胞外并被其他細胞攝取。目前的研究結果表明：至少在移植后18周內，可以通過MRI檢測到標記的細胞[14]。

　　3   核醫學顯像
　　     
　　SPECT和PET為核素示蹤的顯像技術。PET的顯像原理決定了它較SPECT具有更高的空間分辨率和敏感性，其在神經系統中應用最廣泛[15]。SPECT掃描需要準直器，只能檢測到身體發射的小部分γ-射線，影響其敏感性；另外，散射也降低了它的空間分辨率[16]。
　　     
　　各種組織或細胞均有特異或相對特異的分子標志物，利用適當的放射性核素標記這些特異性標志物來作為探針，能夠在活體顯示組織、細胞的存在和狀態。根據感興趣分子與探針的不同，核醫學顯像可以分為代謝顯像、抗體顯像、受體顯像、報告基因顯像和反義顯像。

　　3.1    代謝顯像    其在臨床科研中應用較多。最常用的分子探針是組織和細胞的代謝底物或類似物。如氟-18-脫氧葡萄糖 （18F-FDG） 是葡萄糖的類似物，被細胞攝取后在己糖激酶的作用下完成磷酸化，然后停留在細胞內濃聚而不再參于代謝。18F-FDG掃描可反映葡萄糖的代謝情況，從而間接反映疾病的狀況[17]。Hofmann等[18]研究18F-FDG標記的BMSC在心肌梗死病人心肌中的歸巢情況，結果在心肌梗死區域 （主要是心肌梗死邊緣） 發現了移植細胞。由于葡萄糖和氨基酸代謝是多通路、多分子調節的，故利用代謝顯像示蹤干細胞增殖的特異性較低。Doyle等[17]利用18F-FDG 標記前體細胞，通過冠狀動脈移植治療心肌梗死，利用PET或CT可動態觀察到細胞存活情況。Stelljes等[19]利用18F-FDG-PET做為一種敏感、無創的檢查方法來檢測移植物抗宿主病 （GVHD）。

　　3.2    抗體顯像    抗體顯像是利用抗原、抗體的特異結合，將抗體作為探針，以檢測細胞表面抗原的存在。這一技術的關鍵是獲得同源性抗體，并構造分子量小、呈脂溶性的抗體。

　　3.3    受體顯像    受體顯像是將放射性標記配基引入體內，與特異性受體結合，從而顯示受體作用的部位。受體顯像最有可能首先進入干細胞活體示蹤領域。神經受體顯像劑有相對成熟的藥物或藥物衍生物作為標記底物。國內研究者用11C-raclopride與D2受體結合，進行PET顯像，在神經前體細胞的移植部位看到了明顯的放射性濃聚[20]。

　　3.4    報告基因顯像    報告基因顯像將報告基因 （如GFP） 與靶基因耦聯，通過測定表型蛋白，間接反映靶基因的表達。一種報告基因可以與多種靶基因耦聯，一個報告基因系統能用于多種基因顯像。但必須在體外將報告基因與靶基因耦聯，然后用載體導入動物或人體內。

　　3.5    反義顯像    反義顯像通過螯合劑將核素與反義寡核苷酸連接，在細胞內與靶基因的mRNA互補結合，從而顯像，可反映目標DNA的轉錄情況。雖然這種技術尚未成熟，但其可能是徹底解決干細胞活體示蹤技術的最終途徑。
　　     
　　利用PET示蹤干細胞，在靈敏度、定量分析方面具有較大的優勢，并已在干細胞移植治療帕金森病研究中獲得了很好的效果。但是，目前核醫學顯像仍不能完全解決干細胞活體示蹤的問題，其主要原因是缺乏特異性干細胞標記物。隨著干細胞特異性標記物的發現及分子探針技術的發展，PET將成為最有前途的示蹤干細胞的分子影像學技術。