羅氏454高通量測序平臺的特點及應用
Genome Sequencer FLX (GS FLX)系統是羅氏454 公司的第二代測序臺，GS FLX的命名正是來源于其在多領域的靈活(flexible)應用。隨著該系統性能和應用領域的不斷提升和擴展，必將帶動整個測序領域的技術發展，對大規模基因序列研究的相關應用領域產生巨大的推動作用。美吉生物以先進的羅氏454高通量測序平臺、專業的科研團隊、個性化的實驗方案，為您打造優質的高通量測序服務。
型號：GS FLX System
試劑：long-read GS FLX Titanium chemistry
產量：100萬序列∕Run
讀長：400bp以上
應用：基因組de novo測序、轉錄組de novo測序、宏基因組測序、重測序
貢獻：應用此技術已經發表1026篇學術論文
發展： 2011年將實現測序讀長達到1000bp
測序原理
GS FLX系統的測序原理是基于焦磷酸測序法，依靠生物發光對DNA序列進行檢測。在DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，熒光素酶和雙磷酸酶的協同作用下，GS FLX系統將引物上每一個dNTP的聚合與一次熒光信號釋放偶聯起來。通過檢測熒光信號釋放的有無和強度，就可以達到實時測定DNA序列的目的。此技術不需要熒光標記的引物或核酸探針，也不需要進行電泳；具有分析結果快速、準確、高靈敏度和高自動化的特點。
GS FLX高通量測序方法原理示意圖
實驗流程
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GS FLX系統減少了傳統測序樣品制備過程中對大型自動站的依賴，完全不需要進行繁瑣的建庫過程，也不必進行克隆挑取、微孔板處理等工作，利用創新的磁珠和emPCR技術進行樣品制備，同時提供完整的后續生物信息學分析解決方案。 1) 樣品種類：GS FLX系統支持各種不同來源的樣品序列測定，包括基因組DNA，PCR產物，BACs，cDNA及小分子RNA等，不同類型的樣品測序都可在一臺儀器上完成。 2) 樣品DNA打斷：樣品如基因組DNA或BAC等被打斷成300-800bp的片段；對于小分子的非編碼RNA，這一步驟并不需要。短的PCR產物則可利用GS融合引物擴增后直接進行步驟4)。 3) 加接頭：借助一系列標準的分子生物學技術，將3′端和5′端有特異性的A和B接頭連接到DNA片段上。接頭也將在后繼的純化，擴增和測序步驟中用到。圖中僅僅顯示了后續步驟中要用到的單鏈的DNA片段。 4) 一條DNA片段＝一個磁珠：接頭使成百上千條DNA片段分別結合到一個磁珠上，磁珠被單個油水混合小滴包被后，在這個小滴里進行獨立的擴增，而沒有其他的競爭性或者污染性序列的影響；所有DNA片段進行平行擴增(emPCR)。 5) 一個磁珠＝一條讀長：經過emPCR擴增后，每個磁珠上的DNA片段擁有了成千上萬個相同的拷貝。經過富集以后，這些片段仍然和磁珠結合在一起，隨后就可以放入到Pico Titer Plate板中供后繼測序使用了。 6) 數據讀取和分析工具：GS FLX 系統提供三種不同的生物信息學工具對測序數據進行分析，適用于不同的應用。例如多達3GB序列的重測序，對比已知參考序列進行的擴增產物差異分析及 120MB的從頭測序工作等。 |
技術應用
1.全基因組測序
u 多達120 Mb的未知基因組的測序
1） 生成基因組結構概圖
2） 研究DNA序列的組織，分布和信息
3） 基因篩查：尋找新基因，定位和功能
4） 其他基因組進行比較研究
u 全基因組進行從頭鳥槍法測序，例如微生物基因，BAC和YAC克隆測序
u 比較基因組研究
1） 識別單堿基突變
2） 識別突變熱點和保守區域
3） 識別插入或者缺失的基因
4） 斷定基因型和表型之間的相關關系（如研究藥物抗性的遺傳基礎）
5） 基于基因測序變化進行毒性預測
6） 進行流行病學分析
7） 了解工業生產菌株和它們的親代菌株序列上的差異作為進行工業生產菌株開發的遺傳基礎
8） 進行宏基因組(Metagenomics)研究
9） 古代化石DNA 測序研究
u 利用配對末端方法(Pair-End Tag)將Contigs拼接成Scaffolds
2.轉錄組和基因調節研究
u 基于短Tags，ESTs，ChIP或者GIS-PET序列的高通量轉錄組分析，或miRNA序列的基因組范圍識別，小分子和非編碼RNA的測序
u 研究DNA的甲基化模式來進行基因調節的研究
3.擴增產物分析
u PCR產物的超精細測序（應用于醫學研究的重測序）
1） 在混合的腫瘤樣本中識別體細胞突變
2） 在群體水平上發現高可信度的SNP位點
u 環境微生物物種多樣性深度分析
技術優勢
² Genome Sequencer FLX Titanium 系列
GS FLX測序儀應用升級后的Titanium系列試劑，突破性地實現了第二代測序既確保了每個序列的高質量、高讀長，又兼顧了高通量測序的特性。應用廣泛而穩定，在基因組de novo測序、基因組重測序、目標基因捕獲測序、宏基因組測序和RNA測序分析等研究領域發表了上千篇學術論文。
² 獲得更全面的數據
每次運行能產生100萬條以上的有效序列，以Q20為評判標準，單序列讀長在400bp以上，只需耗時10小時。
² 提升項目實施能力
應用GS FLX平臺可以在一次實驗中實現長序列讀長測序和大片段雙末端測序的完美結合，一次性實驗即可完成一個微生物基因組的de novo測序項目，且能確保最佳拼接效果。
² 降低實驗成本
400bp以上的讀長和超高通量測序能力，使實驗效果最大化，實驗成本最小化。可以根據實驗設計要求靈活選擇測序通量，保證了測序能力的充分利用，實現了實驗節約。
² 提高實驗效率
標準化流水作業的文庫構建流程，避免了常規實驗中的細菌轉化、培養以及單克隆的挑選。emPCR富集全自動工作站使實驗人員從繁瑣的實驗操作中解放出來。² 提供簡單易用的生物信息處理軟件
提供生物信息解決方案
系統屬性
l Titanium 系列試劑
Titanium 系列試劑在試劑、耗材和軟件方面都進行了優化，確保了GS FLX卓越的測序性能。
GS FLX Titanium series performance
| Throughput | 400-600 million high-quality， filter-passed bases per run* 1 billion bases per day |
| Run Time | 10 hours |
| Read Length | Average length = 400 bases |
| Accuracy | Q20 read length of 400 bases (99% at 400 bases and higher for prior bases) |
| Reads per run | >1 million high-quality reads |
| Data | Trace data accepted by NCBI since 2005 |
| Computing Requirements | Cluster recommended (Roche GS FLX Titanium Cluster available) |
| Robustness | No complex optics or lasers, reagents have long shelf life |
測序結果舉例：（平均讀長、序列數取決于樣品特性）
GS FLX測序儀
測序儀全貌 測序儀內部構造
l GS FLX高通量測序儀規格參數
| Dimensions: upper assembly |
74.3 cm W × 69.8 cm D × 36.1 cm H |
| Dimensions: lower assembly | 75.2 cm W × 90.8 cm D × 92.7 cm H (29.62 in W × 35.75 in D× 36.5 in H) |
| Weight | 242 kg (532 lbs) |
| Power supply | 85 - 132 Vac 50/60Hz 173 - 264 Vac 50/60Hz |
| Noise level | <65 dB(A) |
| Electromagnetic emission |
Class A |
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Electromagnetic immunity |
Important: In industrial areas， this device may be influenced by radio interference.
The user should take the necessary precautions, if appropriate. |
性能提升
2011年GS FLX Titanium系列試劑將進行升級，測序讀長能提高到1000bp，超過了ABI 3730XL的測序讀長，極大拓寬了GS FLX的應用范圍。
★ 1Kb讀長結合20Kb、8Kb和3Kb Paired end測序，可以輕松實現基因組de novo完整測序。
★ 在進行轉錄本測序時，1Kb讀長序列可以測通更多的外顯子和可變剪接區域，發現更多基因亞型信息。
★ 長序列可以關聯距離更遠的變異信息，更有利于分型分析。
序列平均讀長達到了746bp，讀長集中在840bp左右
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