王奕軍    通用電氣醫療集團

 

 

    百日咳、白喉、破傷風混合疫苗簡稱百白破疫苗，它是由百日咳疫苗、精制白喉和破傷風類毒素按適量比例配制而成，用于預防百日咳、白喉、破傷風三種疾病。目前使用的有吸附百日咳疫苗、白喉和破傷風類毒素混合疫苗(吸附百白破)和吸附無細胞百日咳疫苗、白喉和破傷風類毒類混合疫苗(吸附無細胞百白破)。目前國內的工藝基本上屬于七八十年代工藝，整個過程中所用的透析步驟,常規過濾的步驟非常多,這樣大大的影響了整個制品的工藝生產進程。

 

    GE公司的中空纖維是設計為開放式通道的切向流膜過濾產品，在整個生物下游分離中具有低剪切力，高活性收率的優點，特別適合處理高濃度、高粘度、高顆粒度樣品的分離。根據中空纖維的獨特的優點，我們對百白破工藝流程中作了一些有益的嘗試，獲得了不錯的結果。

 

圖１:百日咳工藝流程

 

      在整個工藝過程中，我們在第(３)步工藝，透析脫去銨離子的這一步，以及工藝第(6)步,透析去除解毒劑戊二醛這一步分別作了有益的嘗試，取得了不錯的實驗結果。

 

    中空纖維脫銨離子實驗

      圖２Quixstand 系統

 

    實驗膜類型：10KD的濾柱(UFP-10-C-4MA) 。

    實驗條件：泵轉速-200rpm，上樣體積1000ml，過膜壓力 18psi 。

    實驗料液：百日咳工藝第(３)步料液,脫去銨離子之前料液(高速離心后料液) 。

    實驗過程：百日咳工藝第(３)步鹽析沉淀和緩沖液抽提百日咳毒素和絲狀血凝素,之后透析脫去銨離子,傳統工藝上面是高速離心后再透析去除銨離子(高速離心前的料液非常混濁,)整個透析的時間很長,一般需要２天左右,完全是一個工藝的限速步驟,這邊實驗嘗試用分子量 10k分子量的中空纖維代替透析,取得了不錯的實驗結果,基本上在濾出體積為原體積３-４倍左右的時候即可檢查出銨根離子符合工藝要求,整個實驗過程僅需要２小時左右,而且由于中空纖維可以處理高顆粒高粘度顆粒的特性,我們也繼續嘗試把原來非常混濁的料液濃縮2-3倍之后再次洗濾,也是在濾出體積為原體積２-３倍的時候即可達到銨離子合格的結果,這樣可以節約后續的離心體積,也節省了工藝的時間。

 

    中空纖維脫去戊二醛實驗

 

    實驗系統：Quixstand系統

    實驗膜類型：10KD的濾柱(UFP-10-E-4MA)實驗條件:泵轉速-260rpm ,上樣體積 1000ml,過膜壓力15psi 。

    實驗料液: 加入戊二醛進行解毒的百日咳料液工藝流程第(６)步。

    實驗過程: 實驗過程采取了先對料液進行濃縮5倍左右,后續立即洗濾,洗濾體積為8 倍體積后即可達到戊二醛合格的結果在透析去除戊二醛這一步,樣品溶液屬于一個多絮狀的狀態,傳統工藝上透析袋去除戊二醛,一般都需要三天以上的時間,給整個工藝過程帶來了不穩定因素,透析時間過長一方面容易染菌,另一方面也對蛋白的收率活性帶來一定的影響,這邊嘗試用 10k中空纖維代替透析, 在濾出體積為原料液體積８倍以上體積時候即可達到去除戊二醛的目的,另外我們也嘗試實驗過程采取了先對料液進行濃縮5 倍左右,后續立即洗濾,在濾出體積為濾體積為４-５倍體積后即可達到戊二醛合格的結果,,整個工藝時間基本上 2-3 小時,而且操作為全封閉操作,大大的增加了整個生物制品的安全性。

 

圖3:白喉或者破傷風毒素工藝流程

 

    在工藝流程(2)中用絹布過濾來收集上清,整個時間耗時 10 小時或者更長,這么長時間的外置于空氣中,一方面帶來料液容易污染的危險,另外一方面出來的料液澄清度也比較差,會在一定程度上影響最終制品的性質. 我們嘗試著在這一步工藝流程中用中空纖維代替原有的步驟,得到了不錯的經過,不但料液非常澄清,而且活性幾乎沒有損失。

 

 

    實驗系統:Quixstand 系統

    實驗膜類型:0.45um的濾柱(CFP-4-E-4MA)

    實驗條件:泵轉速-320rpm ,上樣體積 1000ml,過膜壓力 5.5psi

    實驗料液: 加入活性炭后進行脫色的料液,工藝流程第(２)步

    實驗過程:采取了先將料液進行濃縮至900ml,之后進行洗濾的方法,在濾出料液體積為原料液體積2.5 倍體積停止實驗,經過活性檢測基本能將發酵液中目的毒素完全濾洗出來,達到了很好的實驗結果,整個實驗耗時兩個小時左右,大大節約了工藝的時間.

 

 

    實驗系統:Quixstand 系統 。

    實驗膜類型:0.45um的濾柱(CFP-4-E-4MA) 。

    實驗條件:泵轉速-320rpm ,上樣體積 1000ml,過膜壓力 3psi。

    實驗料液: 加入活性炭后進行脫色的料液工藝流程第(２)步。

    實驗過程:采取了先將料液進行濃縮至600ml,之后進行洗濾的方法,在濾出體積為原體積2倍體積停止實驗,基本能將發酵液中目的毒素完全濾洗出來,達到了很好的結果,整個實驗耗時兩個小時左右,大大節約了工藝的時間。

    白喉破傷風毒素工藝流程除了這一步之外,實驗也同樣嘗試用 30k中空纖維在白喉以及破傷風毒素上去除銨離子的過程,同樣得到了非常好的結果.在很短的時間內即可把銨根離子去除。

    GE 公司的中空纖維由于獨特的開放式結構,使它能處理高濃度,高粘度,高顆粒的樣品,能代替原有的粗放式過濾,以及透析的過程,達到去除菌體,戊二醛,銨根離子的目的,在百日咳破傷風白喉毒素的工藝過程中得到了很好的應用。

圖四:全自動膜過濾系統

 

    GE 公司提供的中空纖維系列濾柱 (HF) 及系統，具有以下優勢：

●購置/使用成本合理；

● 各種微濾孔徑、超濾分子量可選；

● 大多數濾柱可高壓或者在線蒸汽滅菌；

● 纖維管內徑可選，適合處理高濃度、黏度、顆粒度的樣品；

● 安裝操作簡單 ；

● 全封閉操作；

● 符合 cGMP/FDA 嚴格的安全、可控認證要求；

●GE 公司同時擁有實驗室全自動膜工藝開發以及滿足生產的全自動膜系統,確保滿足客戶從實驗室的工藝優化以及線性放大工作。

圖５  Grandstand 550生產系統