從臍靜脈分離干細(xì)胞

試劑和材料：
1. 培養(yǎng)基：完全LG-DMEM：含2mmol/L的左旋谷氨酰胺的低糖DMEM，添加10%熱滅活胎牛血清，100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素；
2. PBSA；
3. 胰蛋白酶，0.05%，含EDTA；
4. 膠原酶A，0.1%用PBSA配制；
5. 培養(yǎng)瓶；
6. 導(dǎo)管；

實(shí)驗(yàn)方法：
1. 在正常分娩后6-12h內(nèi)收集和處理臍帶；
2. 在臍靜脈內(nèi)插入導(dǎo)管，用PBSA完全地洗2次；
3. 夾住遠(yuǎn)端臍帶；
4. 用0.1%膠原酶溶液充滿靜脈；
5. 夾住近端臍帶；
6. 將臍帶在37℃孵育20min；
7. 輕輕按摩臍帶，收集含有內(nèi)皮和內(nèi)皮下層細(xì)胞的懸浮液，600g離心10min；
8. 用培養(yǎng)基重懸細(xì)胞；
9. 計(jì)數(shù)后，按1×103個(gè)細(xì)胞/cm2的密度將細(xì)胞接種到75cm2的培養(yǎng)瓶中；
10. 3天后更換培養(yǎng)基，除去未貼壁細(xì)胞，保留貼壁的細(xì)胞繼續(xù)生長(zhǎng)，每3天更換一次新鮮培養(yǎng)基，至大約2周后可見(jiàn)成纖維樣細(xì)胞生長(zhǎng)；
11. 在這種情況下，用0.25%胰蛋白酶/EDTA收集細(xì)胞，傳代到新培養(yǎng)瓶中繼續(xù)擴(kuò)增；