摘要

應用高分辨率熔解曲線技術進行基因分型不僅簡單而且有效。基于熔解曲線的分析方法中，探針法是進行基因分型的金標準，能夠全面的檢測匹配的目的等位基因。小片段擴增法是一種不需要設計探針進行基因分型的方法。由于異源雙鏈的存在，雜合子很容易檢測，而這很大程度上改變熔解轉化的峰形。純合子基因分型中G/C或A/T的改變是最難檢測的，因為它們的等位基因有相似的Tm值。那些稱為中性純合子的堿基對使用小片段法是很難區分。此外，純合子難區分也受樣品與樣品間溫度的變化，緩沖液和體積的限制。無論多么精確的儀器，相關的變化可能是顯著的，所以需要一種方法來減少這種變化并且改善小片段基因分型。而使用特異性內標就可以克服這些限制。

背景

人工合成的寡核苷酸內標和互補序列包含相同的分子濃度。在內標存在的情況下，使用普通96孔板PCR儀，并添加LC Green® Plus染料進行PCR反應。PCR反應完成后將PCR產物放入Lightsanner儀器，在55℃到97℃進行熔解曲線分析。內標的溶解識別通過每個樣品的熒光數據進行校準。基因型通過測序進行驗證。通過測量每個樣品組相應的基因型的Tm值峰間的距離來估算校正前后的純合基因型檢測的錯誤率。當樣品的Tm值與錯誤組的Tm值接近時，錯誤將被檢測到。

結果

通過使用不同微孔板和PCR模板驗證，使用溫度內標校準后，純和基因型在中性單核苷酸多態性堿基對檢測的靈敏度提高了90%到99%以上。使用溫度內標后Tm值標準較低大約0.056到0.027℃。

結論

內標提高小片段內的純和基因型G/C和T/A堿基的改變。該研究被國家衛生部以下部分津貼支持：R44DK069106 、R44HD053215 to SFD 、 R42GM072419 和R42GM073396 to CTW。

背景

變性或熔解時，由于核酸固有特性的不同使得基因型信號會發生變化。基于探針的基因分型在相關的大量的等位基因特異性在溫度變化幾度上有較大的優勢。高分辨率熔解曲線提供了整個雙鏈的熔解圖并且可以去掉探針。此外，每個實驗當整個擴增子被監測時，獲得的堿基審問數量增加達20倍。由于非常相似的熔解圖和熔解溫度，使純和基因型在沒有探針的情況下檢測難度增加。小片段提供了一個簡單的基因分型方案。
值得注意的是，與大片段擴增子相比小片段擴增能夠更好的進行純合子檢測，因為特異基因型Tm值變化將更大。但是，某些因素可以影響大量純合子的分離。從堿基類型Tm值變化到設備變化和樣品和樣品的不同都能影響基因分型。溫度內標可以減小這些變化，固定熔解轉變和提高基因分型的靈敏度。當小片段引物僅僅對側翼的SNP匹配時，將會得到最好的結果。

方法

PCR反應體系10 μL，反應體系中加入1X LightScanner高靈敏度Mastermix，該Mastermix包含熱啟動酶，鎂離子緩沖液，其它成分和核酸校準，該PCR的熔解區間大約在62C和92C。體系中包括0.10μM或0.15 μM的引物，人基因組DNA10-15 ng。PCR循環條件如下：95C預變性2min，94C/30s，64-67C/30s(根據實驗而定)包含退火和延伸，45個循環。最后的退火條件為28C/30s。所有DNA樣品的基因型通過探針法檢測。
熔解在96孔板的LightScanner設備上進行，數據采集從55-97C。熔解后數據校準首先使用接近熒光數據的平滑線條，接下來，將使用該數據的線條插值峰計算Tm值。這一調整過程可以校準每個擴增子的熔解峰，以達到最小的變化。數據重新使用LightScanner軟件進行分析。擴增子Tm值附近的溫度區域用于分析（有或沒有以前內標校準）同時以衍生峰顯示。

結果

使用溫度內標前的完整熔解圖見圖1，圖中標出了從低溫內標到高溫內標的熔解圖，中間為擴增子的熔解圖。

圖1. 衍生的熔解曲線顯示了內標和擴增子的熔解峰。內標的熔解峰在左右兩側。94個熔解圖產生于獨立的PCR反應，熔解峰大約出現在76C。內標分子沒有校準，純合子的峰沒有完全分開。中間最窄的和最高的峰是A/A(藍色)和T/T(紅色)，它是CPS1 A/T多態性的純和基因型。先前基于探針的基因分型顏色已經增加,不是基于這個小片段熔解數據。中間的另一個峰是A/T雜合子峰。插圖顯示的是放大的熔解峰。
                       

圖2. 使用溫度內標能夠改善衍生的熔解曲線。熒光圖顯示了CPS1、OTC,MSH2和PAH突變94個獨立的PCR反應。雙峰CPS1雜合子在校準前很容易被區分出來（圖2a）。相反，OTC雜合子（圖2c）僅顯示了一條主要的峰，更多的峰在校準前很難區分。使用溫度內標后的基因型數據分更加容易，重復反應中沒有發現出現不同的基因型。

表1  比較每個目的基因使用溫度內標前后四個重復的Tm。在所有情況下，校準后差異降低。可以看出，校準后標準差和非感興趣區域差異都降低。

                                                    表1.校準對Tm值影響的統計

表1. 每個重復盤包含了相同設置的47個基因組DNA樣品（94個獨立的PCR反應）。基于所有純合子鄰近參數預測的Tm列于表中。雜合子Tm值不包含在內，因為它們通常在我們的系統中不用校準就可以分型。在某種程度上，由于LCGreen染料的存在，穩定的DNA雜交得到的實際Tm值要比理論值高5-7℃。基因分型沒有調準是指未校準和標定Tm值有顯著差異。（p＜0.001）。
對于CPS1和OTC PCR產物，分析預測近鄰值未發現純合子T/T和A/ATm的不同。然而，兩個靶基因，即使沒有校準， 純合子群體Tm值也是不同的。盡管，從看到的Tm值范圍上看，校準前純合子T/T和A/A重疊。校準后，純合子T/T和A/A沒有重疊，說明純合子已經區分開了（表1）。對于MSH2和PAH小片段產物，鄰近值分析預測純和擴增子之間有小的Tm值差異。校準前分析純合子間的變化顯示不能清楚的區分基因型。校準后，純合子基因型的錯誤估測見表2。

                                               表2.校準提高純合子檢測靈敏度

表2. 實驗數據顯示了校準對靈敏度的影響。可以看出校準后檢測靈敏度提高10%。實驗中，正確的估計基于近似的Tm值， 而不是Lightsanner軟件預測。每個目標小片段的錯估預測將顯示出來。
*OTC T/A突變的rs數未標出。

軟件自動校準

隨后的工作是用Lightsanner 軟件自動對相似的圖像的樣品進行分組。這種圖形的基因分型不需要對Tm值了解。對在這種基于Tm值的基因分型已經經過證實，這種基于圖形的分型受益于溫度內標的使用。圖3可以看出通過校準CPS1的小片段產物得到改善。

圖3. 溫度內標能夠改善Lightsanner軟件自動校準。下面的顯示板顯示了歸一化后的熔解曲線和不同屏幕截圖。此外，從分組情況可以看出，屏幕上左方的盒子的紅蘭灰顏色在1-6列和7-12列是重復的模式。在這個資料組校準前得到的靈敏度是92%，校準后得到的靈敏度是100%。

校準降低Tm值對反應量的依賴性

Tm值依靠反應量預測，因為在反應板中更多的Mastermix或礦物油將阻礙熱量的傳遞。這將提高顯示的Tm值。我們使用OTC小片段測試Tm值對Mastermix反應體積的依賴。從7.0 μL到12.5 μL，以0.5 μL遞增（廠家推薦為10μL）。Tm值對反應量的依賴性在校準前是很大的（slop=+0.069，R2=0.078），但在校準后（slope=-0.001，R2=0.066）,見圖4。校準可以有效降低量對Tm值的影響。

圖4.校準前后Mastermix體積對Tm值的影響。擴增OTC基因的47個樣品評估C.299-8T＞A突變。該反應添加1 μL DNA模板，采用7.5 1 μL到12.5 1 μL以0.5 μL遞增的Mastermix。A板顯示的是校準前重要突變的熔解圖。B板顯示的是校準后減少的突變。C板顯示的是35T/T純合子樣品校準前Tm值對Mastermix的量依賴性。校準后可觀察到兩種情況：1）誤差線將壓縮，突變顯示減少2）斜率和R2值將大大減少，說明Tm值和Mastermix的量關系不大。對于每個反應在板子的不同方位分布，是為了降低Tm值對樣品位置的依賴。

結論

小片段熔解是一種簡單的基因分型方法，它不需要對樣品進行PCR后處理。盡管較小的片段能夠很好的進行基因分型。但是，沒有溫度內標的純合子基因分析的成功不僅取決于高分辨率的數據采集，而且取決于樣品間buffer、體積和提取的均一性。有效的校準可以消除這些混合因素的變化，以便于更好的相對穩定的進行純合子基因分型。

參考文獻
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