正常視網膜色素上皮細胞原代培養
正常視網膜色素上皮細胞原代培養
實驗材料：
1. 材料來源：人眼、兔眼或者豬眼等；
2. 清洗液：不含Ca2+和Mg2+的1×PBS，添加100IU/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素，pH7.2；
3. 特殊取材器械：眼球托與7-0尼龍線。以滅菌的白色橡膠反口膠塞作為眼球托；
4. 消毒液：200IU/ml的慶大霉素生理鹽水；
5. 消化液：0.01%EDTA-0.125%胰蛋白酶的混合消化液；
6. 培養液：為含10%胎牛血清的DMEM培養液；
7. 培養器皿：培養瓶、24孔培養板或培養皿若干；
實驗方法：
1. 摘取眼球，用200IU/ml的慶大霉素生理鹽水浸泡消毒5min。沿鋸齒緣后2—3mm處環形剪開眼球前段，去除角膜、晶狀體以及玻璃體。分離去掉視網膜神經上皮層。將眼球后段制成眼杯；
2. 將眼杯置于眼球托（可以洗凈消毒過的鹽水瓶膠塞替代）上，取持針器用7-0尼龍線在4個對稱方向上，把眼杯縫合固定在眼球托的壁緣上；
3. 用毛細吸管輕輕從眼杯中吸出視網膜神經上皮層。以PBS液漂洗眼杯2次，吸干；
4. 加入0.01%EDTA-0.125%胰蛋白酶的混合消化液，置于無菌的燒杯中。于37℃恒溫箱中消化30min；
5. 吸去消化液。用PBS液稍洗。加入有血清培養液終止消化酶的作用，并用毛細吸管輕輕吹打眼杯內壁，以使視網膜色素上皮細胞脫落；
6. 收集眼杯內的細胞懸液，離心（800r/min）8min；
7. 棄上清液，將沉淀的視網膜色素上皮細胞重新用培養液懸浮。計數；
8. 以8×104—10×104個/ml的密度接種于培養瓶中；
9. 送人培養箱中，按常規方法培養，每周換液2次；
10. 也可直接用機械分離植塊法：用無齒鑷撕下視網膜色素上皮細胞層，經PBS漂洗后，將其剪成1.5mm×1.5mm大小的組織塊，直接接種于24孔培養板進行培養；
標簽：
正常視網膜色素上皮細胞原代培養
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