real-time PCR 數據分析
無論所使用的real-time PCR是何種型號，正確的數據分析對于獲得有效的實驗結果都是至關重要的。這里介紹有關real-time PCR數據分析的知識。
在討論基本分析過程之前，先介紹如何設計一個好的實驗。如果你是自己設計的引物和探針，那有助于下一步的工作。但是在有些情況下，人們使用出版文獻上的序列會更方便。記住，即便是出版物提供的序列也不能保證會得到優化的實驗結果。而且排版錯誤的可能性也需要考慮在內。所以進入實驗室之前使用BLAST對全部序列進行核實確保他們是正確的。下訂單前先檢察引物和探針的序列和Tm值是實驗設計的基本要求。
標準曲線是判斷實驗質量的重要手段。使用一個已知的模板，PCR產物，合成的寡核苷酸或轉錄的RNA做個標準曲線能夠確定PCR的效率，敏感性，動態范圍和其他的參數。建立標準曲線時使用OD260的模板樣本。模板的總量以DNA分子的數量來描述，把質量轉化為DNA含量的公式如下：
（質量（克）*阿伏伽德羅常數）每個堿基的平均質量*模板的長度。
例如，合成70-mer的單鏈DNA，樣本質量為0.8*10ˆ-11gm。代入公式得：
（0.8*10ˆ-11*6.023*10ˆ23molecules/mole）330gm/mole/base*70 base。
如果使用雙鏈的模板，則堿基的平均質量為660gm/mole/base。
標準曲線使用的模板含量從1*10ˆ7開始連續稀釋7次每次稀釋10倍，最終得到10個模板拷貝。這樣的濃度有助于得到最高的ΔRn和最低的Ct。用Excel畫曲線時以模板數量的對數值為X，Ct（cycle threshold）值為Y軸。標準曲線的計算公式如下：
y=mx+b。y就是Ct，m是斜率，x=log10template amount，b=y-intercept。
用斜率計算出實驗效率Efficiency【10ˆ（-1/斜率）】-1。實驗效率告訴我們PCR反應的執行情況。鑒定系數rˆ2是實際結果和理論值相符程度，表示稀釋和移液的準確性。y-intercept說明實驗的敏感度和模板含量的精確度。
通過已知的模板含量，可以計算合成一定的DNA含量需要多少次循環：
n=Log（Nn）-Log（N0）/Log（1+E）
Nn是n次循環后的模板含量，N0是原來的模板含量，E是實驗效率Efficiency，n是所需的循環數。
一個完美實驗的斜率是-3.32，效率Efficiency是100%，y-intercept在33到37次循環之間，r^2是1.00。如果效率（Efficiency）較低，y-intercept較高，這意味著循環開始時DNA的含量不足或需要多跑幾個循環。可以接受效率Efficiency在95-100%之間的實驗結果，但如果y-intercept大大高于37或低于33，這說明沒有準確的查明樣本數量。通常偏高的y-intercept值是以低濃度存儲，反復冷凍解凍造成樣本變性的結果。以標準曲線證實實驗有效后，就能把同樣的規范用于cDNA或RNA來優化樣本準備。
設備運行后的數據分析建議按照以下的步驟進行。
1. Amplification curves。
如果沒有這個曲線或看上去不正常，一定要查明原因解決問題。首先應檢查染色層（dye layer）和指定的reporter，看似簡單的方法確是最有可能的解釋。如果曲線看上去很不規則，可能是樣本中沒有熒光劑，或者是加樣口根本沒有樣本。具體是那種情況大約在40次循環后就可以判明，解決方法是調節設備放棄那些無用的加樣口，使曲線得以連貫。
2. Baseline
所有的real-time PCR都用基線（Baseline）在早先的幾次循環時來檢測背景噪音和熒光劑里的試劑。這樣不完整的弧線出現在正式的讀出數據之前，大約在第1個到第10個循環之間。如果Ct的最低值小于基線的上限，應該調整基線值。通常設置2-3個循環基線的上限低于Ct最低值。判斷基線設置是否合適可以觀察增擴曲線（amplification curve）Y軸(ΔRn)的線性表達而不是對數方式，有時對數曲線上看似較好的趨勢在線性圖上則能反映出問題。如果上限過高，會出現在基線之下很低的Ct。調節基線直到曲線的直線部分與基線相仿。正確的調節會使得彩虹狀殘缺的對數曲線消失。同樣地，極限的上限可能會過低，也可以觀察線性增擴曲線來了解。調節基線的影響主要在于低Ct的樣本或高含量的模板，如果必須重復試驗，稀釋模板2倍就相當于把Ct系數改變1。
下一步的重點在設置正確的閾值。當所有增擴標定點處于指數級增長階段，用對數值顯示Y軸。不太可能設置閾值能適合所有的曲線，一個實驗里采用多種閾值只適用于mRNA含量低造成ΔRn非常低的情況。有人認為閾值盡可能比較好，有些分析軟件調整閾值造成標準曲線有很高的R^2。還有人認為最精確的Ct來源于選擇SDM最大的曲率。其實并沒有最佳的閾值，設置低造成低Ct也許有益于某些情況。樣本含量上2倍的差異帶來Ct值1倍的變化，對效率（efficiency）的影響接近100%。
3. 污染控制（No template controls，NTC）
確保測試的是樣本為不是污染物，建議在正式樣本前的加樣孔中加入2-3個無模板對照樣本。加入正式樣本前先封閉對照組，同樣準備2-3對照樣本在加樣完成后加入。這個步驟能發現樣本是否被污染及其程度。NTC顯示Ct值低于40，可以檢查增擴曲線來了解詳情。如果曲線平穩的增加不存在指數級的提高，或增擴速度很慢，用線性圖觀察ΔRn圖形。一種情況是下降的ROX同時FAM不變。另一種是FAM上升但ROX不變。使用多重試圖檢查每個加樣孔的所有熒光試劑，搞清楚報告的信號和有關染料的關系。如果是輕度污染，可以調節閾值來消除影響或移除有關的加樣孔。如果NTC出現指數級增擴，會是先前實驗留下的PCR產物造成的。處理方法：用dUTP (2’deoxyurindine 5’triphosphate)和酶UNG(uracil-N-glycosylase)替換dTTP。
4. 無逆轉錄控制（No reverse transcription control）
如果real-time PCR用于mRNA定量分析，需要評估樣本中染色體污染物的總量。加入一個不含逆轉錄酶的樣本（-RT）。如果-RT的結果是陽性的，可以用DNase處理樣本去掉主要的污染物但會減低RNA的產量，或設計引物/探針跨基因間區，或一直使用逆轉錄控制。
陽性控制
陽性控制最好的方法是標準曲線。用它來做量化分析，斜率和y-intercept反映了實驗質量。如果不能使用一條人工標準曲線，一條覆蓋小段DNA或全長RNA的標準曲線能反映出實驗的效率。如果實驗沒有增擴效果，把注意力放在試劑和模板可能存在的問題上。
5. 實驗樣本
不同廠商的探針會有不同的表現和不同的最大ΔRn值，這個差別能從實質上影響ΔRn。但它們不會妨礙指數級增擴，只要增擴期間在設置好閾值相關數據就可用于分析工作。
有可能出現當ROX平穩下降，一些曲線在指數級增擴前是平行的狀況。還有可能看似存在增擴的曲線其實是假的。分析軟件會盡其所能處理數據，然而如果ΔRn大大的低于1，應該直接懷疑沒有真正的增擴存在無論曲線看上去如何。
6. CV（coefficient of variance）
CV（coefficient of variance）是標準偏差除以算數平均，用來測量實驗內的再現性和實驗的變化。如果CV值較小對實驗沒有影響。如果一個加樣口的值明顯不同于其他的，重復后的實驗任然出現這樣的結果，使用多成分窗口（multicomponent view）或光譜窗口（raw spectra）檢查增擴情況。如確實沒增擴就需檢查是否加入了探針熒光劑，也要可能缺少了探針。排除了探針的可能性后再檢查是否加入了模板。如果異常加樣口的Ct較低，可能模板被加了2次。重復加入模板只會降低Ct 1，如果CV值大，這個想象不會被發覺。另一個推測是容器沒有很好的密封，一些加樣口或試管里的試劑蒸發了。
7. 定量數據
完成初步的實驗和分析后，下一步要決定如何有意義地比對數據。量化mRNA和DNA的標準曲線有時作為絕對量化的參考。標準曲線允許在質量基礎上計算總量未知的樣本，但是無論材料濃度的精確性如何，最終結果是相對于一個單位的定義。大部分設備的軟件可以按事先指定的單位計算總量，也可按以下的公式：
Log10 copy number = Ct–y-intercept/slope。
重要的是檢驗你的試劑能夠給出100%的反應效率。沒必要指望你的樣本里會有一個能給出精確的基因表達測量。有關規范化和相對量化的內容本文不做展開討論。
8. 數據統計
實驗完成了，數據也分析了，還有什么可做的？還有很多，real-time PCR統計與大量參數有關，如實驗過程中的細胞收獲，核苷酸，提取技術，逆轉錄，PCR條件和試劑等情況。使用你的數據之前有必要先進行統計整理。數據的表達取決于實驗的目的，如測試受某因素影響前和后的基因表達，正常細胞對比癌癥細胞，時間的影響等等。另一類如食物、水、環境中的微生物含量，確認生物芯片、siRNA的結果等等。
根據實驗的類型，有關數據應該按一定的原則整理有助于讀者觀察到變化，包括數據含義，標準差，置信區間。有些統計用于告訴讀者存在重大差異的可能性，大多數real-time PCR是檢驗假設的結果，有時這些差異很明顯統計步驟只是走過場。但是生物系統是不斷變化的，不精確的，有時統計能說明數據的排他性。
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