亞細胞構造的離心分離典型實驗

一）簡介：

用簡易的差分離心結合各種型式的密度梯度離心可以分離和純化各種亞細胞器。研究者也可以根據自己的設備情況對實驗參數做一定的改動，也可以更多地利用速率-區帶密度梯度離心或等密度離心來簡化實驗過程和提高分離純度。

二）實驗：

ⅰ）勻漿制備：

 鼠肝12克加入0.25M蔗糖與5mM Tris-HCL(PH7.4)共45ml用“概論”中建議的勻漿設備與方法制備成勻漿待用。

ⅱ）實驗流程：

 

該實驗流程中

沉Ⅰ：細胞核、質膜大片段、重線粒體，少量未破碎細胞及極少量沉Ⅱ→沉Ⅳ的成分。

沉Ⅱ：重線粒體、質膜片段，及少量沉Ⅲ→沉Ⅳ成分。

沉Ⅲ：線粒體、溶酶體，高爾基膜，部分粗內質網及極少量沉Ⅱ→沉Ⅳ成分。

沉Ⅳ：所有的細胞質可溶部分。

離心Ⅰ：低速冷凍離心機，50ml管。離Ⅱ，離Ⅲ為高速冷凍離心機8x50ml角轉頭。

離Ⅳ為超速機或高速機8x50ml角轉頭或8x12ml角轉頭

ⅱ）從沉Ⅱ中純化線粒體：

勻漿保持在200ml甘露醇，50ml蔗糖，1mM EDTA,10mM Hepes-NaOH(ph7.4)中，全部操作均應使勻漿在冰浴中，產生沉Ⅱ后去除上清表面以及離心管壁部的脂肪（這一點很重要）。

加20ml保持液到沉Ⅱ中稀釋到30ml，3000gx10分再次離心并重復以上過程二次以上，最后的沉淀保持在10ml保持液中。

ⅲ）從沉Ⅳ中部分純化光滑微粒體：

保持液為0.25M蔗糖，5mM Tris-Hcl(ph7.4)沉淀中光滑微粒體成松軟狀態位于緊密狀態的粗糙微粒體沉淀之上。

小心地倒掉上清Ⅳ后，在沉Ⅳ中加入2-3ml保持液，輕搖，大部分光滑微粒體（沉ⅣA）將分散到清液中，而沉Ⅳ（B）（粗糙微粒體，緊密沉淀）仍在沉降中，倒出沉沉Ⅳ（A），余下的沉Ⅳ（B）加入2-3ml保持液即完成。

ⅲ）從沉Ⅰ中部分純化質膜：

保持液用  1mM NaHCO₃

鼠肝加25ml保持液在研缽中錘擊15次，仍用1mM NaHCO₃稀釋到100ml，攪拌2分鐘并用孔徑為75µm的尼龍布過濾。然后離心得到Ⅰ加5ml 1mM NaHCO₃到沉Ⅰ中再放入勻漿器，慢速往復2-3次，再用1mM NaHCO₃稀釋到15ml，用甩平轉頭10ml玻璃錐形管，1200g離心10分鐘，不用制動減速到停止，沉淀很明顯由三層組成。輕輕搖動或攪動即可使最上層的線粒體溶入上清液，中間層富含質膜，最下層是細胞核。倒去上清加入5ml 1mM NaHCO₃輕搖使中間層進入溶液，注意要盡可能少地擾動下層核沉淀。將再次倒出的上清液稀釋到15ml并重復以上離心過程即可進一步純化質膜。

ⅳ）從上Ⅲ中分離粗糙和光滑微粒體：

從已經去掉線粒體的上Ⅲ中可以比從沉Ⅳ中更有效地分離粗糙及光滑微粒體，配置溶液

0.6M 蔗糖，5mM Tris-HCL(PH8.0)

15mM CSCL,1.3M蔗糖，0.25M蔗糖

用角式轉頭，10-13ml厚壁PC（聚碳酸酯）離心管，先注入3ml1.3M蔗糖5mM Tris-HCL，再注入1.5ml0.6M蔗糖，5mM Tris-HCL從而形成了一個在離心管下部的階梯形密度梯度。在梯度上部注入上Ⅲ直至充滿離心管，100000gx90分鐘。離心后得到二個主要部分，在0.6M蔗糖界面處或稍下一點是光滑微粒體，沉淀是粗糙微粒體。

用針筒吸出光滑微粒體。沉淀用三倍容積的5mM Tris-HCL(PH8.0)稀釋后再次離心160000gx30分，得到粗糙微粒體沉淀，再用2-3ml的0.25M蔗糖與5mM Tris-HCL(PH8.0)稀釋即可。

ⅴ）從勻漿中純化細胞核：

配置溶液：0.25M蔗糖在TKM(0.05M Tris-HCL PH7.5)中及2.3M蔗糖在TKM中，25mM KCL 5mM MgCl₂

將鼠肝放在研缽中加0.25M蔗糖-TKM，沖研10- 15次，用紗布過濾后加入二倍容積的2.3M蔗糖-TKM，這樣就使蔗糖的濃度為1.62M(該濃度最好用光折射儀檢測確認，5℃折射率1.4115,20℃時，1.4137)。

將此溶液9ml注入PC離心管，在溶液下部注入3-4ml2.3M蔗糖-TKM，130000gx30分，5℃，甩平轉頭。

離心后倒去上清液即為核沉淀。它可以根據研究者需要用合適的緩沖劑稀釋。

ⅵ）從沉Ⅰ中純化細胞核：

取沉Ⅰ，用旋渦混合器分散沉淀并加入等容積的60%（W/W）蔗糖-TKM，放入勻漿器上下抽動2-3次，繼續加入60%（W/W）蔗糖-TKM直至蔗糖濃度達到55%（W/W）。用折射儀檢測（5℃折射率1.4356,20℃時，1.4328）。取該溶液9ml移入14mlPC離心管，管下部鋪3-4ml60%（W/W）蔗糖液，在甩平轉頭中120000g 5℃離心30分鐘，倒去上清液。余下的核沉淀可用合適的緩沖液稀釋。為了消除沉淀中的膜，在制備勻漿時可用0.5% Triton x-100清洗。這種做法既消除了膜，又不影響核的結構。

ⅶ）從沉Ⅰ中純化質膜：

配置溶液：60%（W/W）蔗糖液，37.2%（W/W）蔗糖液均分別加在5mM Tris-HCL(PH8.0)中將已制備好的沉Ⅰ剩余的緩沖液一起用渦旋混合器混合后再加入60%（W/W）蔗糖使蔗糖終濃度為48%，并用折射儀檢測（5℃折射率1.4181,20℃時，1.4150）。取以上溶液6ml注入14mlPC離心管，上鋪6ml37.2%（W/W）蔗糖液以1ml PH7.4緩沖液。在甩平轉頭中160000g，5℃，離心3小時。

質膜聚集在37.2%（W/W）蔗糖液的上部，用注射器吸出，并用三倍容積的5mM Tris-HCL

(PH8.0)稀釋后再在100000g，5℃，離心40分鐘，沉淀即為質膜。

ⅷ）從沉Ⅰ中純化重線粒體：

配置溶液：0.25M蔗糖，10mM Hepes-NaOH(PH7.6),1mM EDTA,1mM MgCl₂,2.4M蔗糖，將沉Ⅰ用0.25M蔗糖，10mM Hepes-NaOH(PH7.5),1mM MgCl₂ 稀釋到15ml。要盡可能避免動及沉淀最底部的紅色部分。將已稀釋部分倒出，混勻后加入23ml 2.4M蔗糖，10mM Hepes-NaOH(PH7.5),1mM MgCl₂，所得到的最終蔗糖濃度為1.0 M。

用光折射儀測定（5℃折射率1.3827,20℃時，1.3812）如需要，進行調節，將此液體倒入一個50mlPC管，上鋪8ml0.25M蔗糖，10mM Hepes-NaOH(PH7.5)在35000g，5℃離心10分鐘，倒去上清液并擦凈沾在離心管壁上的物質。沉淀很清楚有二層，順離心管內壁加入10ml 0.25M蔗糖，10mM Hepes-NaOH(PH7.5)，1mM EDTA，輕輕晃動并稀釋沉淀的上部褐色重線粒體層。

對于其他組織材料的線粒體細化問題。請參照“Methods in Enzynology”第55卷。

ⅸ）從沉Ⅲ中純化溶酶體及粒體：

配置溶液：0.3M，1.1M,2.1M蔗糖的線性梯度可以用梯度形成儀做成，也可以用不連續梯度（1.1M,1.4M,1.7M,2.1M,每種2.5ml）在5℃靜置12-16小時也會形成連續的1.1M-2.1M近線性梯度。

在沉Ⅲ中加入10ml，0.3M蔗糖，輕搖，慢慢得可以看到離心管底部沉積了暗褐色的沉淀（溶酶體）倒去上清，加入4ml0.3M蔗糖液在勻漿器中磨勻（注意：活塞與器壁要松一些）。取2ml以上勻漿置于線性梯度（1.1M-2.1M蔗糖）之上，輕攪勻漿使其與梯度液之間的界面盡可能減少密度的不連續，在甩平轉頭中95000g，5℃離心4小時。

離心后，溶酶體區帶形成于1.20-1.26g/cm³密度之間（在離心管下部），而線粒體則形成于1.17-1.21g/cm³密度之間（在離心管中部。溶酶體區帶中密度較高的部分相對較純。）

ⅹ）從沉Ⅱ及沉Ⅲ中純化高爾基膜：

配置梯度溶液：38.7%，36%，33%，29%（W/W）蔗糖液每種均加入5 mM Tris-HCL(PH8.0)

用上清Ⅰ離心，10000g，5℃ 20分鐘得到沉Ⅱ+沉Ⅲ

用5ml 0.25M蔗糖，5mM Tris-HCL(PH8.0)稀釋沉淀，恒溫攪拌并使溶液的蔗糖濃度上升到43.07%（W/W），用光折射儀檢測（5℃折射率1.1979,20℃時，1.1957）

在PC離心管中（13ml）由下往上依次鋪設如下層次：

3ml樣品（蔗糖濃度43%w/w），4ml 38.7%蔗糖液，2ml 36%蔗糖液，2ml 37%蔗糖液，2ml 29%蔗糖液，在甩平轉頭中100000g，5℃離心1小時，用注射器收集含有高爾基膜的上部二個區帶。

我們也可以用這個方法從全勻漿中來分離純化高爾基膜，勻漿中蔗糖濃度配到43.7%，然后用以上不連續梯度來分離純化，但是對于大容量勻漿，直接法是不合適的。

小結：以上典型實驗以鼠肝勻漿為原料，以差分離心為主，輔以蔗糖的連續或不連續梯度分離各種亞細胞器，方法簡單易行，成本也較低。我們也可以用Ficoll,percoll,Metrizamid, Nycodenz,……等等梯度材料來分離純化亞細胞器。

 

作者：余興明   電話：13764301893,yuxingming@techcomp.cn