亞細胞構造的離心分離概論
現代生物學研究常常需要提取和純化細胞及組織中的亞細胞構造（細胞核、質膜、內笪綱、高爾基體、線粒體、溶酶體、微粒體等等）。在經過選擇的最合適的生物體勻漿制備后，用離心法提取和純化亞細胞構造是最常用、也是最有效的實驗手段。
（一）勻漿制備：
將生物體組織剪切成2~3毫米小塊或小片，以每100毫升加濕重5~10克配置組織液，即可用下列各種勻漿設備制備勻漿。
（i）帖床式勻漿機：
最常用，可調速，磨頭可手操作升降的實驗室勻漿機。
常用聚四氟乙烯園柱型帶球形頂端的磨頭。定制的硬質玻璃容器，磨頭在玻璃容器中既旋轉又上下移動。磨頭與容器間隙可根據需要調整在0.05~0.15毫米之間。
制備某些大溫度敏感的材料，容器可固定在一個封閉園筒中，園筒通以冷卻水，避免勻漿制備過程中這樣品溫度升高。冷卻水可用自來水也可以用低溫循環水槽的外循環冷卻水。
這種勻漿機最常用于"軟"組織（腦、肝等）的勻漿制備，常用將速在1500轉/分以下，磨頭上下升降5~15次。
（ii）剪切型勻漿機。
轉頭分為硬度、可產生相對剪切運動的多刀刃刀片，轉速較高（10000轉/分）下，可調。適用于較"硬"組織（肌肉，心肌，內臟等等）的勻漿制備。
（iii）高壓 氣體破碎法（主要是N2）：20~100大氣壓，10~60分鐘也可以制備勻漿。
（iv）超聲波破碎機：可產生很高的液體剪切力。但對生物大分子（DNA，RNA等）有破壞作用，常用于只研究亞細胞結構的勻漿制備。
（v）大量樣品用的制備型工業勻漿泵：綜合利用機械剪切與細胞真空炸裂原理制造的高效勻漿（均質）設備用于生產型勻漿制備。
（二）過濾：根據樣品的實際情況，在勻漿制備前或會，為了濾去某些不得不 破碎的組織顆粒，可用優質棉布或尼龍布（單層或多層）過濾樣品。
（三）供參考的初步離心法：
（四）亞細胞構造的進一步純化：
(i)溶劑：為了避免質膜及其他亞細胞器的損傷，保證在離心過程中組織不變性，常用的溶劑有1mM EDTA, 0.1~1mM PMSF, 5~10mM Tris或Hepes等等，具體配置請參閱有關文獻。
(ii)差分法：經過多次繁復的差分離心分離也可以純化各種亞細胞器，但常常是事倍功率：很大的離心工作量，得到不太高的純度。由于離心技術的進展，目前已少用，本文不作介紹。（如果有人感興趣，可與作者聯系）
(iii)密度梯度離心法：（略，詳見參考文獻）
① 各種亞細胞構造的沉降系數范圍：
細胞核：5×106~8×106
質膜（大片）：105~6×105
質膜（小片）：5×101~5×103
內質綱片斷：101~103
溶酶體，線粒體：2×103~8×103
②各種亞細胞器的尺寸及其在典型梯度材料中的浮密度：
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名稱 |
尺寸 |
密度 | ||||
|
（µ m） |
蔗糖中 |
Ficoll |
Percoll |
Metrizamid |
Nycodenz | |
|
核 |
3~12 |
>1.3 |
/ |
1.09 |
1.22 |
1.23 |
|
線粒體 |
0.5~2 |
1.19 |
1.14 |
1.10 |
1.16 |
1.17 |
|
溶酶體 |
0.5~0.8 |
1.21 |
/ |
1.06 |
1.13 |
1.15 |
|
質膜（大片）小顆粒 |
3~20 |
1.16~1.18 |
~1.05 |
~1.03 |
1.14~1.26 |
1.11~1.19 |
|
0.05~3 |
1.13 | |||||
|
內質網 |
0.05~0.3 |
1.06~1.23 |
/ |
/ |
/ |
/ |
③推薦的離心參數
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方法
名稱 |
差分沉降在0.25M蔗糖液中 |
速率—區帶密度梯度離心5~20g蔗糖液中5℃ |
等密度離心(ISOPYCNIC)(同左或其他合適介質中) |
|
核 |
1000g×10分鐘 |
500g×10分鐘 |
4000g×60分鐘 |
|
線粒體 |
10000g×20分鐘 |
5000g×10分鐘 |
80000g×100分鐘 |
|
溶酶體 |
10000g×20分鐘 |
5000g×10分鐘 |
80000g×100分鐘 |
|
內質網 |
150000g×40分鐘 |
10000g×20分鐘 |
100000g×200分鐘 |
|
微粒體 |
100000g×60分鐘 |
10000g×30分鐘 |
10000g×360分鐘 |
|
質膜大片 |
10000g×15分鐘 |
~100000g×100分鐘 |
~150000g×600分鐘 |
|
（小顆粒） |
100000g×60分鐘 |
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