全自動核酸分子診斷系統的某些進展

        劉賓 覃斌兵 劉洪娜 何農躍

(東南大學生物電子學國家重點實驗室 江蘇南京210096)

 

摘 要 隨著后基因組時代的到來，全自動核酸分子診斷系統得到了廣泛的應用。本文立足于國內外醫療儀器市場全自動核酸分子診斷系統的現狀，介紹了全自動核酸分子診斷系統的基本組成及其關健技術。在此基礎上介紹了國際上全自動分子診斷系統的主要生產商及其產品，并對具有代表性的幾個產品的特點進行了分析。最后對全自動核酸分子診斷系統的發展進行了展望。

關健詞 全自動;高通量;分子診斷;單核苷酸多態性

 

Liu Bin, Qin Binbing, Liu Hongna, He Nongyue

(Southeast University, State Key Laboratory of Bioelectronics, Nanjing Jiangsu, 210096)

Abstact With the post-genome era coming, fully automated nucleic acid molecular diagnostic system has been used widely. In view of existing situation of the fully automatic nuclear acid molecular diagnostic system in medical apparatus and instument market, the principle of the fully automatic nuclear acid molecular diagnostic system is introduced.The characters of representative products are analyzed. At last, the development of fully automatic nuclear acid molecular diagnostic system is prospected.

Key words  Fully automatic; High throughput;Molecular diagnostics; SNPs

 

分子診斷是指利用核酸或蛋白質作為生物標記進行臨床檢測的診斷技術，為疾病的預測、診斷、預防、治療和轉歸提供了信息和決策依據。特別是面對各種突發性傳染性疾病，其最經濟有效的措施就是快速、準確的分子診斷。分子診斷的發展很大程度上受分子診斷儀器自動化的影響。人類基因組計劃的完成，日臻完首的分子診斷方法，使得分子診斷自動化得到了進一步的發展。

全自動分子診斷系統能夠實現多樣本，多位點的快速的高通量檢測，它不儀能夠將研究人員從實驗臺邊上解放出來，滿足人們對大量生命信息進行分析的要求、大大加快實驗和研究進程，而且具有適合臨床應用的檢側方法，因此在實驗室和臨床檢驗中得到了越來越廣泛的應用。

    以基于磁分離的全自動分子診斷系統為例，其基本功能框圖如圖1所示。

    大多數全自動分子診斷系統包括以下幾個功能模塊:樣本提取、樣本處理、高通量樣本檢測與分析等。其硬件系統一般包括:精確移液模塊、機械抓板臂、精確溫控模塊、信號檢測模塊等。

全自動分子診斷系統能夠完成“樣本制備一靶分子富集或擴增一信號檢測一數據分析”的生物分子檢測分析的全過程自動化。其中涉及到的關鍵技術包括基于功能性磁性納米顆粒（Functional Magnetic Nanoparicles, FMNPs）的樣本提取與處理技術、生物靶分子的獲取與放大技術、高通量信號檢測技術等。

     1997年，Hawkings等提出了基于磁性納米顆粒分離和富集功能的DNA提取技術^[3] 。磁性納米顆粒提取是一個簡單、快速、有效的DNA分離方法，整個操作過程無需離心或柱分離。無需使用有機溶劑及其它有毒試劑，可實現高通量自動化操作，特別適用干全自動工作站。2006年，Berensmeie等將傳統的 DNA提取方法和基于磁性納米顆粒的提取方法進行了比較^[4]，指出采用磁性納米顆粒提取模板DNA，可以去除許多影響后續聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction, PCR）的雜質，提高PCR擴增的穩定性。此外，一定量的磁性納米顆�？梢晕�附一定量的DNA，有助于獲得相對恒量的模板DNA。Thermo Scientific公司提出的Kingfisher專利技術通過磁棒轉移磁珠從而轉移樣品，避免了DNA提取過程中繁瑣的液體處理過程，使得平行的純化樣品的高通量化成為可能。

 PCR反應通常在均一的溶液中進行，而在納米顆粒表面實現PCR擴增已成為目前的一個研究熱點。2000年，Adessi和Huber等人提出了基于固相的PCR技術，并在此基礎上研究了玻璃表面的PCR,探討了研制相應DNA芯片的可能性^[5]；2007年，Lermo等人研究了基于磁性納米顆粒表面的PCR，并用電化學的方法檢測食物中的病原休^[6]。

     此外，已經有國外研究者利用磁性納米顆粒進行基因突變點檢測。 2003年，東京農業大學Matsunaga教授及其研究小組首先制備了親和素修飾的細菌磁性納米顆粒（Bacteria magnetic particles, BMP）,然后利用BMP發展了一系列的單核苷酸多態性(Single Nucleotide Polymorphism，SNPs分型方法，同時還發展了一套基于96孔板的自動操作系統，但是這些檢測方法相對比較耗時，且不易實現高通量化。2005年，Kakihara及其研究小組利用磁性納米顆粒作為反應載體固定生物素標記的延伸引物，與純化的PCR產物退火后，延伸上標記有堿性磷酸酶的雙脫氧核苷三磷酸（dideoxyribonucleotide triphosphate, ddNTP），最后通過化學發光方法檢測SNPs^[8]。該方法能夠準確對樣本進行分型，但分型前首先需要進行PCR擴增和產物的純化濃縮，操作過程相對復雜。

     2007年，劉洪娜等利用磁性納米顆粒PCR擴增(MNPs-PCR)和等位基囚特異性雙色熒光探針(Cy3，Cys)雜交技術，建立了一種單核昔酸多態性分型的新方法^[9]。此方法無須產物純化、濃縮，掃描分型結果快速、直觀，是一種操作簡單、快速，高通量、高靈敏度的分型方法，而且容易實現自動化。2008年，劉洪娜等提出了一種應用磁性顆粒和通用連接子擴增技術(Adaptor-PCR)的多位點SNP分型方法^[10]。通過連接子PCR擴增樣本的全基因組產物，實現了對多個樣本多個SNP位點的同時檢測，避免了復雜的多重引物擴增。該方法能夠在短時間內完成對大量樣本的多個位點分型，且分型結果直觀，誰確，正錯配信一號比值高(>3 .0)。

     2009年，何農躍等提出的基干磁性納米顆粒的PCR擴增和雙色熒光通用標簽的高通量SNP分型技術被作為一種通用的分子生物學方法編入了Methods in Molecular Biology系列叢書中。同年，課題組提出了一種基于磁分離的單堿基循環延伸的點突變檢測方法^[12]。該方法以磁性納來顆粒作為載體，在其上進行.單堿基循環延伸，實現對樣品的準確分型。此方法的最大優點是避免了由于錯配探針雜交產生的假陽性信號，因此共有極高的誰確性口同時。循環延伸所用靶序列為基因組DNA而作傳統單堿基延伸法中所用的經純化的PCR產物，因而反應步驟大大簡化且非常容易實現自動化操作。

 

      自從1980年，第一臺臨床自動化樣本處理裝置被投入使用以來，越來越多的實驗室自動化裝置被設計、生產，投入使用。全自動裝置由于具有智能、快速、準確以及不知疲倦的工作能力，它的使用能夠大人提高實驗室工作效率，帶來強大的高通量繪測能力，將研究者從高強度的重復勞動中解放出來。隨著時代的發展，其檢驗領域及所能涵蓋的檢測項目正逐漸豐富，全自動設備在臨床診斷以及治療監測等方面也發揮出越來越重要的作用。日前全球很多公司從事全自動檢測設備的開發與研究，表1列出了一些國際知名自動化處理、檢側設備的生產商。

 

表1、國際上分子診斷系統主要廠商及產品

Table 1 The main corporation and products of fully automation molecule diagnostic system i

 

 

     其中比較著名的有英國的TAP(The Automation Partnership)。全球最大的實驗室自動化系統供應商之一，其產品分為細胞培養與處理系統、樣品管理與篩選系統兩大類，提供一系列細胞培養與檢側相關的自動化系統。其中的SelecT系統能夠提供高通量細胞培養和檢測樣木板制備，Piccdol系統能夠提供自動優化蛋白質樣品制備，Cello系統能夠自動完成高通量克隆操作，而Homebase系統能夠對生物或化學樣品進行自動化存儲與管理。

     Beckman Culter 是全球知名生命科學設備供應商，主要產品為Biomok系列自動工作站系統，被廣泛應用十基因組研究研究領域。其系統能夠完成各種樣品的DNA/RNA提取與純化、PCR反應體系建立及產物純化、核酸適配子(Aptamer)篩選等實驗。該系列產品在自動操作方而功能較強，操作精確度高，用戶界面友好，操作方便，因而具有較高的市場占有率。

     世界知名分子診斷公司羅氏，開發出COBAS AMPLICORRTM Analyzer全自動PCR診斷系統，它將熱循環、自動化加樣、孵育、清洗與光密度測量五種儀器組合在一起，在同一儀器上實現了聚合酶鏈式反應擴增與檢側步驟的自動化，可用于病原體的定性或定量檢測等。

     我國全白動分子診斷設備的開發僅處于剛起步階段，市場上很少有國產成熟的擁有自主知識產權的集樣本處理與分析于一體的實驗室白動化設備。國內所使用的自動化設備基本為進口產品，固定的設備(生產線、儀器設查)，缺乏靈活性，使得進口儀器往往不太適應中國國情，不適用于國內一般醫院，從而大大限制獷自動化裝置在我國的普及。

     縱觀當前全自動分子診斷設備的發展趨勢，最為突出的關瀚概念是“統一化’、“集成化”以及“微型化”。

   “統一化”是指全自動分子診斷設備中應當確立一個統一的行業標準。從2000年起，美國國家臨床實驗室標淮委員會National Committee for Clinical Laboratory Standards，NCCLS)和國際臨床實驗室標淮委員會（International Committee for Clinical Laboratory Standards, ICCLS)合作一直致力于制定全自動分子診斷設備統一的標誰^[13]。因此，在未來的自動化設備研制中，可以優先考慮“先軟后硬”設計方法，首先要建立功能強大、且能夠升級的分子診斷策略，然后根據確立的檢側策略設計與之配套的硬件，這樣建立的自動化檢測平臺不但能大大降低儀器開發的風險，而且將來產品推向市場不會存在無配套產品的市場風險。

    “集成化”是指將各種先進分析儀器模塊化后集成到一個系統中。隨著對生物大分子分析、檢濺自動化需求的日趨強烈，對自動化設備的功能也提出了新的要求，自動化設備需要能夠將樣本存貯、樣本制備、分析反應二信號檢測和分析等功能集成，將各種不同的功能模塊優化整合在一起。“集成化’并不是將各種滾先進的儀器模塊堆砌在一起，而是根據希望實現的目的，選擇合適的檢側方法與檢測器，合適的液體轉移方式，合適的質量控制模式，優化選擇、組合集成，以期能夠將檢測方法在儀器上完美實現。

   “微型化’是指將全自動分子診斷系統小型化以適應個體化醫療的要求，以應用于家庭、小型醫療機構以及即時診等。“微型化”并不是將功能簡化，而是利用先進的微電子、微流控芯片等技術，使全自動分子診斷設備的體積進一步縮小，以滿足不同群體的需求。

    當前，國內的醫療器械研究機構應盡快開展關干全自動分予診斷儀器的研究，解決其中關鍵向題，研制出具有自主知識產權的全自動分子診斷系統，打破國外高端分子診斷系統在國內的壟斷地位，從而填補國內在這一領域的空白。