細(xì)胞總乙酰化水平的快速測(cè)定方法
細(xì)胞總乙酰化水平的快速測(cè)定方法
-------免疫親和色譜-ELISA 方法
步驟一：親和色譜分離提純乙酰化蛋白
1. 用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，10000rpm 離心2 分鐘，取上清備用。
2. 取20-40ul 抗乙酰化賴氨酸抗體填料(Anti-acetylated lysine Agarose,ICP0388，如右圖所示)，
用PBS 洗2 次，每次1ml。
3. 將細(xì)胞裂解上清液與洗好的填料（ICP0388）混勻，39oC 旋轉(zhuǎn)搖床低速孵育60 分鐘。
4. 1000rpm 離心1 分鐘，去上清，用PBSt 重懸沉淀，1000rpm 離心1 分鐘，去上清，重復(fù)3 次，
最后一次用PBS 洗，吸棄上清。
注：細(xì)胞裂解液里應(yīng)該含有蛋白酶抑制劑，組蛋白乙酰化酶抑制劑等。
步驟二：釋放及包被固定分離提純的乙酰化蛋白
5. 用20ul 0.1M HCL 將步驟2 的抗賴氨酸抗體填料-乙酰化蛋白復(fù)合物于沸水中煮2 分鐘，10000rpm
離心1 分鐘，將上清液體全部轉(zhuǎn)移到含有80ul 的0.2M Na2CO3 的ELISA 薄板上，39oC 孵育30 分鐘；
6. 取出ELISA 薄板，拍干。用PBSt 清洗2 次，每次均需拍干。加入100ul 含0.5%BSA 的PBSt ，39oC
封閉10 分鐘。
步驟三：用抗乙酰賴氨酸抗體HRP 標(biāo)記物檢測(cè)蛋白乙酰化水平
7. 取出ELISA 薄板，拍干，用PBSt 清洗2 次，拍干。加入100ul 濃度為0.25ug/ml 抗賴氨酸抗體
HRP 偶聯(lián)復(fù)合物（Anti-acetylated lysine HRP conugates,ICP0381，如右圖所示），39oC 孵育30 分鐘。
8. 取出ELISA 薄板，拍干，用PBSt 清洗板孔3 次，每次均需拍干。加入100ul TMB 液，39oC 孵育顯色
10-20 分鐘。最后加入100ul 0.1 M H2SO4 終止反應(yīng)，在450nm 波長下讀數(shù)。
