為使基因擴增檢驗技術有效地應用于臨床，更好地為疾病的預防、診斷和治療服務，保證檢驗質量，特制定本規范。

一、臨床基因擴增檢驗實驗室的規范化設置及其管理
臨床基因擴增檢驗實驗室的規范化設置詳見《臨床基因擴增檢驗實驗室管理暫行辦法》(衛醫發[2002]10號文)附件《臨床基因擴增檢驗實驗室基本設置標準》。為避免污染，必須嚴格遵循《臨床基因擴增檢驗實驗室設置標準》設置臨床基因擴增檢驗實驗室。
臨床基因擴增檢驗實驗室四個隔開的工作區域中每一區域都須有專用的儀器設備。各區域都必須有明確的標記，以避免設備物品如加樣器或試劑等從其各自的區域內移出從而造成不同的工作區域間設備物品發生混淆。進入各個工作區域必須嚴格遵循單一方向順序，即只能從試劑貯存和準備區、標本制備區、擴增反應混合物配制和擴增區(簡稱擴增區)至產物分析區，避免發生交叉污染。在不同的工作區域應使用不同顏色或有明顯區別標志的工作服，以便于鑒別。此外，當工作者離開工作區時，不得將各區特定的工作服帶出。
清潔方法不當也是污染發生的一個主要原因，因此實驗室的清潔應按試劑貯存和準備區至擴增產物分析區的方向進行。不同的實驗區域應有其各自的清潔用具以防止交叉污染。

(一)試劑貯存和準備區
下述操作在該區進行：貯存試劑的制備、試劑的分裝和主反應混合液的制備。

貯存試劑和用于標本制備的材料應直接運送至試劑貯存和準備區，不能經過產物分析區。在打開含有反應混合液的離心管或試管前，應將其快速離心數秒。試劑原材料必須貯存在本區內，并在本區內制備成所需的貯存試劑。當貯存試劑溶液經檢查可用后，應將其分裝貯存備用，避免由于經常打開反應管吸液而造成污染。
含反應混合液的離心管或試管在冰凍前都應快速離心數秒。大多數用于擴增的試劑都應冰凍貯存。為避免因單次反應取液而頻繁的凍融主貯存試劑，應分裝冰凍貯存試劑溶液。貯存試劑的分裝體積根據通常在實驗室內一次測定所需的擴增反應數來決定。
主反應混合液的組成成份尤其是聚合酶的適用性和穩定性通過預試驗來檢查，評價結果必須有書面報告。對于“熱啟動”技術(在第一個高溫變性步驟后加入酶)，聚合酶也可不包含在主反應混合液中。
在整個本區的實驗操作過程中，操作者必須戴手套，并經常更換。此外，操作中使用一次性帽子也是一個有效地防止污染的措施。
嚴禁用嘴吸取液體，加樣器和吸頭等必須經高壓處理。
工作結束后必須立即對工作區進行清潔。本工作區的實驗臺表面應可耐受諸如次氯酸鈉的化學物質的消毒清潔作用。實驗臺表面的紫外照射應方便有效。由于紫外照射的距離和能量對去污染的效果非常關鍵，因此可使用可移動紫外燈(254nm波長)，在工作完成后調至實驗臺上60~90cm內照射。由于擴增產物僅幾百bp，對紫外線損傷不敏感，因此紫外照射擴增片段必須延長照射時間，最好是照射過夜。實驗室及其設備的使用必須有日常記錄。

(二)標本制備區
下述操作在該區進行：臨床標本的保存，核酸(RNA、DNA)提取、貯存及其加入至擴增反應管和測定RNA時cDNA的合成。

要正確使用加樣器。由于在加樣操作中可能會發生氣溶膠所致的污染，所以應避免在本區內不必要的走動�？赏ㄟ^在本區內設立正壓條件避免從鄰近區進入本區的氣溶膠污染。為避免樣本間的交叉污染，加入待測核酸后，必須蓋好含反應混合液的反應管。對具有潛在傳染危險性的材料，必須有明確的樣本處理和滅活程序。
用過的加樣器吸頭必須放入專門的消毒(例如含次氯酸鈉溶液)容器內。實驗室桌椅表面每次工作后都要清潔，實驗材料(原始血標本、血清標本、提取中的標本與試劑的混合液等)如出現外濺，則必須分別處理并作出記錄。
對實驗臺適當的紫外照射(254nm波長，與工作臺面近距離)適合于滅活去污染�？梢苿幼贤饩�管燈可用來確保工作后對實驗臺面的充分照射。
樣本處理對核酸擴增有很大影響，必須使用有效的核酸提取方法，可在開展臨床標本檢測前對提取方法進行評價。
用于RNA擴增檢測的樣本制備好以后，應立即進行cDNA合成，因為cDNA鏈較RNA穩定，保存相對容易。為保證逆轉錄反應的需要，應在標本制備區設置一個以上的溫育裝置。
cDNA合成的理想溫度依所使用的酶而定，傾向于使用一步法：即使用在擴增反應緩沖液條件下具有逆轉錄活性的熱穩定的DNA聚合酶進行逆轉錄，其較cDNA合成后再開蓋以調節緩沖液或加入聚合酶進行擴增發生污染的可能性降低。
待測RNA的cDNA拷貝須保存在標本制備區，不得在本區對樣本進行PCR擴增。

(三)擴增區
下述工作在本區內進行：DNA或cDNA擴增。
此外，已制備的DNA模板和合成的cDNA(來自樣本制備區)的加入和主反應混合液(來自試劑貯存和制備區)制備成反應混合液等也可在本區內進行。在巢式PCR測定中，通常在第一輪擴增后必須打開反應管，因此巢式擴增有較高的污染危險性，第二次加樣必須在本區內進行。
不能從本區再進入任何“上游”區域，可降低本區的氣壓以避免氣溶膠從本區漏出。 為避免氣溶膠所致的污染，應盡量減少在本區內的走動。如有加樣則應在超凈臺內進行。打開預處理過的反應混合液時必須防止液體濺出，尤其是在巢式擴增步驟之間。一個簡單的方法是在打開反應管前快速離心數秒。可使用體積較小的離心機，因其所占實驗臺面小，易于用一只手操作，適合于大多數超凈臺。防潮屏障如石蠟油或輕礦物油也具有防污染作用，但必須注意的是，礦物油本身也可能成為一種持續性的污染源。用過的加樣器必須注意清潔消毒。
完成操作及每天工作后都必須對實驗室臺面進行清潔和消毒，紫外照射方法與前面區域相同。如有溶液濺出，必須處理并作出記錄。

(四)擴增產物分析區
下述操作在本區內進行：擴增片段的測定。
核酸擴增后產物的分析方法多種多樣，如膜上或微孔板上探針雜交方法(同位素標記或非同位素標記)、瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳、Southern轉移、核酸測序方法等。目前國內的商品試劑盒絕大部分均采用非同位素標記的微孔板上探針雜交方法，即PCR-ELISA方法，也有膜上探針雜交方法。
本區是最主要的擴增產物污染來源，因此必須注意避免通過本區的物品及工作服將擴增產物帶出。在使用PCR-ELISA方法檢測擴增產物時，必須使用洗板機洗板，廢液必須收集至1mol/L HC1中，并且不能在實驗室內傾倒，而應至遠離PCR實驗室的地方棄掉。用過的吸頭也必須放至1mol/L HCl中浸泡后再放到垃圾袋中按程序處理，如焚燒。
由于本區有可能會用到某些可致基因突變和有毒物質如溴化乙錠、丙烯酰胺、甲醛或同位素等，故應注意實驗人員的安全防護。
本區的清潔消毒和紫外照射方法同前面區域。本區如采用負壓條件或減壓情況下(如安裝排風扇)可減少擴增產物從本區擴散至前面區域的可能性。


二、臨床基因擴增檢驗實驗室質量保證
臨床基因擴增檢驗實驗室質量保證涉及到整個基因擴增檢驗的所有階段，即測定分析前的標本采集處理、測定中的核酸提取、擴增和產物分析以及測定后的結果報告等。

(一)標本的采集
常用于基因擴增檢測的臨床標本包括EDTA或枸櫞酸鈉抗凝全血或骨髓、血清或血漿、痰、腦脊液、尿及分泌物等。采血液等樣本時，應使用一次性密閉容器，如真空采血管。當使用非密閉采樣系統時，如尿、分泌物和骨髓的采樣，必須注意防止來自采樣者的皮屑或分泌物的污染。采樣時必須戴一次性手套。
玻璃器皿在使用前應高壓處理，因為玻璃器皿常含有不易失活的RNA酶。最好是熱滅菌，250℃烘烤4小時以上可使RNA酶永久性失活。
全血和骨髓標本必須進行抗凝處理。EDTA和枸櫞酸鹽是首選的抗凝劑。不能使用肝素抗凝，因為肝素是Taq酶的強抑制劑，而且在其后的核酸提取步驟中很難去除。
臨床用于RNA(如HCV RNA)擴增檢測的血標本建議進行抗凝處理，并盡快(3小時以內)分離血漿，以避免RNA的降解。如未作抗凝處理，則抽血后，必須在1小時內分離血清。

(二)標本的穩定化處理
用于DNA擴增檢測的標本，采集后一般不需要特殊的穩定化處理，但標本應及時送至實驗室。
由于RNA易受RNA酶的降解，因此用于RNA測定的標本有時必須進行穩定化處理，如流行病學調查的現場采樣。異硫氰酸胍鹽(Guanidine thiocyanate,GITC)可使DNA酶和RNA酶立即失活，因此在采集標本時，可將標本材料如血清或血漿按1:4的比例加至含有5mol/L GITC的試管中，從而使血清(漿)中的RNA酶不可逆失活。經上述穩定化處理后，標本一般不需要冷藏即可郵寄。對于特定的檢測項目，上述穩定化處理方法的效果究竟如何，要使用相應的逆轉錄PCR測定方法來評價。

(三)標本的運送
標本采集后必須盡快送至實驗室。經過適當穩定化處理的標本可在常溫下通過郵寄運送。如用于DNA擴增檢測的EDTA抗凝全血標本及用于RNA擴增檢測的經GITC穩定化處理的標本。通常在運送時，應采用不易破碎的容器裝載標本。用于RNA檢測的標本，如果未經穩定化處理，則必須速凍后，放在干冰中運送。

(四)標本的貯存
臨床體液標本如血清/血漿等可于-70℃下長時間貯存。用于DNA測定的已純化核酸樣本可在10mmol/L Tris-1 mmol/L EDTA緩沖液(pH 7.5-8.0)中4℃保存。用于RNA測定的已純化核酸樣本應在緩沖液中-80℃或液氮中貯存。用乙醇沉淀的核酸樣本貯存在-20℃即可。用GITC處理的RNA標本在室溫可保存7天。

(五)標本的處理(核酸提取)
標本處理即核酸提取純化是決定擴增檢測成敗的關鍵性步驟，在使用商品核酸提取試劑提取臨床標本中的核酸模板前，應對其進行充分評價以驗證其提取的有效性。通常，核酸制備質量不高是由于抑制物去除不完全所致，抑制物可能來源于標本本身(如血紅素及其前體或降解產物)或核酸提取過程