發酵染菌：指在發酵過程中生產菌以外的其他微生物侵入了發酵系統，從而使發酵過程失去真正意義上的純種培養。

     染菌對發酵的影響

1、青霉素發酵過程：由于許多雜菌都能產生青霉素酶，因此不管染菌是發生在發酵前期、中期或后期，都會使青霉素迅速分解破壞，使目的產物得率降低，危害十分嚴重。

2、核苷或核苷酸發酵過程：由于所用的生產菌種是多種營養缺陷型微生物，其生長能力差，所需的培養基營養豐富，因此容易受到雜菌的污染，且染菌后，培養基中的營養成分迅速被消耗，嚴重抑制了生產菌的生長和代謝產物的生成。

3、檸檬酸等有機酸發酵過程：一般在產酸后發酵液的pH值比較低，雜菌生長十分困難，在發酵中、后期不太會發生染菌，主要是要預防發酵前期染菌。

4、谷氨酸發酵：周期短，生產菌繁殖快，培養基不太豐富，一般較少污染雜菌，但噬菌體污染對谷氨酸發酵的影響較大。

二、染菌發生的不同時間對發酵的影響

1、種子培養期染菌

種子培養主要是使微生物細胞生長與繁殖，此時，微生物菌體濃度低，培養基地營養十分豐富，比較容易染菌。

若將污染的種子帶入發酵罐，則危害極大，因此應嚴格控制種子染菌的發生。

一旦發現種子受到雜菌的污染，應經滅菌后棄去，并對種子罐、管道等進行仔細檢查和徹底滅菌。

2、發酵前期染菌

在發酵前期，微生物菌體主要是處于生長、繁殖階段，此時期代謝的產物很少，相對而言這個時期也容易染菌。

染菌后的雜菌將迅速繁殖，與生產菌爭奪培養基中的營養物質，嚴重干擾生產菌的正常生長、繁殖及產物的生成。

3、發酵中期染菌

發酵中期染菌將會導致培養基中的營養物質大量消耗，并嚴重干擾生產菌的代謝，影響產物的生成。

有的染菌后雜菌大量繁殖，產生酸性物質，使pH值下降，糖、氮等的消耗加速；菌體自溶，致使發酵液發粘，產生大量的泡沫，代謝產物的積累減少或停止；

有的染菌后會使已生成的產物被利用或破壞。

從目前的情況來看，發酵中期染菌一般較難挽救，危害性較大，在生產過程中應盡力做到早發現、快處理。

4、發酵后期染菌

由于發酵后期培養基中的糖等營養物質已接近耗盡，且發酵的產物也已積累較多，如果染菌量不太多，對發酵影響相對來說就要小一些，可繼續進行發酵。

對發酵產物來說，發酵后期染菌對不同的產物的影響也是不同的，如抗生素、檸檬酸的發酵，染菌對產物的影響不大；肌苷酸、谷氨酸等地發酵，后期染菌也會影響產物的產量、提取和產品的質量。

發酵異常現象及原因分析

發酵過程中的種子培養和發酵的異常現象是指發酵過程中某些物理參數、化學參數或生物參數發生與原有規律不同的改變，這些改變必然影響發酵水平，使生產蒙受損失。對此應及時查明原因，加以解決。

一、種子培養和發酵的異常現象

1、種子培養異常（表現為培養的種子質量不合格）：菌體生長緩慢；菌絲結團；代謝不正常。

2、發酵異常：菌體生長差；pH值過高或過低；溶解氧水平異常；泡沫過多；菌體濃度過高或過低；菌體生長差。

二、染菌的檢查和判斷

發酵過程是否染菌應以無菌試驗的結果為依據進行判斷。

在發酵過程中，如何及早發現雜菌的污染并及時采取措施加以處理，是避免染菌造成嚴重經濟損失的重要手段。因此，生產上要求能準確、迅速的檢查出雜菌的污染。

目前常用于檢查是否染菌的無菌試驗方法主要有：顯微鏡檢查法、肉湯培養法、平板（雙碟）培養法、發酵過程的異常觀察法（如溶氧量）等。

此法檢查雜菌最簡單、最直接、最常用。必要時還可進行芽胞染色或鞭毛染色。

1、顯微鏡檢查法（鏡檢法）

用革蘭氏染色法（Grams stain）對樣品進行涂片、染色，然后在顯微鏡下觀察微生物的形態特征，根據生產菌與雜菌的特征進行區別、判斷是否染菌。如發現有與生產菌形態特征不一樣的其它微生物的存在，就可判斷為發生了染菌。

2、肉湯培養法（用于檢查培養基和無菌空氣是否帶菌，同時此法也可用于噬菌體的檢查）

通常用葡萄糖酚紅肉湯作為培養基，將待測樣品直接接入經完全滅菌后的肉湯培養基中，分別于37℃、27℃進行培養，隨時觀察微生物的生長情況，并取樣進行鏡檢，判斷是否有雜菌。

葡萄糖酚紅肉湯培養基配方：0.3％牛肉膏、0.5％葡萄糖、0.5％NaCl、0.8％蛋白胨、0.4％酚紅溶液，pH 7.2。

3、平板劃線培養或斜面培養檢查法

將待測樣品在無菌平板上劃線，分別于37℃、27℃進行培養，一般24h后即可進行鏡檢觀察，檢查是否有雜菌。有時為了提高平板培養法的靈敏度，也可將需要檢查的樣品先置于37℃培養6h，使雜菌迅速增殖后再劃線培養。

4、注意點

無菌試驗時，如果肉湯連續三次發生變色反應（紅色→黃色）或產生混濁，或平板培養連續三次發現有異常菌落的出現，即可判斷為染菌；

有時肉湯培養的陽性反應不夠明顯，而發酵樣品的各項參數確有可疑染菌，并經鏡檢等其它方法確認連續三次樣品有相同類型的異常菌存在，也應該判斷為染菌；

一般來講，無菌試驗的肉湯或培養平板應保存并觀察至本批（罐）放罐后12h，確認為無雜菌后才能棄去；

無菌試驗期間應每6h觀察一次無菌試驗樣品，以便能及早發現染菌。

三、發酵染菌原因分析

1、染菌的雜菌種類分析

2、發酵染菌的規模分析

大批量發酵罐染菌：

 部分發酵罐染菌：

      個別發酵罐連續染菌（如果采用間歇滅菌工藝，一般不會發生）：大都由于設備滲漏造成，應仔細檢查閥門、罐體或罐器是否清潔等。

3、不同污染時間分析

A、染菌發生在種子培養階段，或稱種子培養期染菌。通常是由種子帶菌、培養基或設備滅菌不徹底，以及接種操作不當或設備因素等原因而引起染菌。

B、在發酵過程的初始階段發生染菌，或稱發酵前期染菌。大部分也是由于種子帶菌、培養基或設備滅菌不徹底，以及接種操作不當或設備因素、無菌空氣等原因而引起。

C、發酵后期染菌大部分是由空氣過濾不徹底、中間補料染菌、設備滲漏、泡沫頂蓋以及操作問題而引起。

     雜菌污染的預防

一、種子帶菌及其防治

1、保藏斜面試管菌種染菌、培養基和器具滅菌不徹底、種子轉移和接種過程染菌、種子培養所涉及的設備和裝置染菌。

2、嚴格控制無菌室的污染，根據生產工藝的要求和特點，建立相應的無菌室，交替使用各種滅菌手段對無菌室進行處理；在制備種子時對砂土管、斜面、三角瓶及搖瓶均嚴格進行管理，防止雜菌的進入而受到污染。為了防止染菌，種子保存管的棉花塞應有一定的緊密度，且有一定的長度，保存溫度盡量保持相對穩定，不宜有太大變化；對每一級種子的培養物均應進行嚴格的無菌檢查，確保任何一級種子均未受雜菌污染后才能使用；對菌種培養基或器具進行嚴格的滅菌處理，保證在利用滅菌鍋進行滅菌前，先完全排除鍋內的空氣，以免造成假壓，使滅菌的溫度達不到預定值，造成滅菌不徹底而使種子染菌。

二、空氣帶菌及其防治

要杜絕無菌空氣帶菌，就必須從空氣的凈化工藝和設備的設計、過濾介質的選用和裝填、過濾介質的滅菌和管理等方面完善空氣凈化系統。

1、加強生產環境的衛生管理，減少生產環境中空氣的含菌量，正確選擇采氣口，如提高采氣口的位置或前置粗過濾器，加強空氣壓縮前的預處理，如提高空壓機進口空氣的潔凈度。

2、設計合理的空氣預處理工藝，盡可能減少生產環境中空氣帶油、水量，提高進入過濾器的空氣溫度，降低空氣的相對濕度，保持過濾介質的干燥狀態，防止空氣冷卻器漏水，防止冷卻水進入空氣系統等。

3、設計和安裝合理的空氣過濾器，防止過濾器失效。選用除菌效率高的過濾介質，在過濾器滅菌時要防止過濾介質被沖翻而造成短路，避免過濾介質烤焦或著火，防止過濾介質的裝填不均而使空氣走短路，保證一定的介質充填密度。當突然停止進空氣時，要防止發酵液倒流入空氣過濾器，在操作中要防止空氣壓力的劇變和流速的急增。

三、操作失誤導致染菌及其防治

1、通常對于淀粉質培養基地滅菌采用實罐滅菌較好，一般在升溫前先通過攪拌混合均勻，并加入一定量的淀粉酶進行液化；有大顆粒存在時應先經過篩除去，再行滅菌；對于麩皮、黃豆餅一類的固形物含量較多的培養基，采用罐外預先配料，再轉至發酵罐內進行實罐滅菌較為有效。

2、在滅菌升溫時，要打開排氣閥門，使蒸汽能通過并驅除罐內冷空氣，一般可避免“假壓”造成染菌。

3、要嚴防泡沫升頂，盡可能添加消泡劑防止泡沫的大量產生。

4、避免蒸汽壓力的波動過大，應嚴格控制滅菌溫度，過程最好采用自動控溫。

5、發酵過程越來越多的采用自動控制，一些控制儀器逐漸被應用。一般常采用化學試劑浸泡等方法來滅菌。

四、設備滲漏或“死角”造成的染菌及其防治

設備滲漏主要是指發酵罐、補糖罐、冷卻盤管、管道閥門等，由于化學腐蝕（發酵代謝所產生的有機酸等發生腐蝕作用）、電化學腐蝕、磨蝕、加工制作不良等原因形成微小漏孔后發生滲漏染菌。

染菌的挽救和處理

一、種子培養期染菌的處理

1、一旦發現種子受到雜菌污染，該種子不能再接入發酵罐中進行發酵，應經滅菌后棄之，并對種子罐、管道等進行仔細檢查和徹底滅菌。

2、采用備用種子，選擇生長生產無染菌的種子接入發酵罐，繼續進行發酵生產。

3、如無備用種子，則可選擇一個適當菌齡的發酵罐內的發酵液作為種子，進行“倒種”處理，接入新鮮的培養基中進行發酵，從而保證發酵生產的正常進行。

二、發酵前期染菌的處理

1、當發酵前期發生染菌后，如培養基中的碳、氮源含量還比較高時，終止發酵，將培養基加熱至規定溫度，重新進行滅菌處理后，再接入種子進行發酵；

2、如果此時染菌已造成較大的危害，培養基中的碳、氮源的消耗量已比較多，則可放掉部分料液，補充新鮮的培養基，重新進行滅菌處理后，再接種進行發酵。

3、也可采取降溫培養、調節pH值、調整補料量、補加培養基等措施進行處理。

三、發酵中、后期染菌處理

1、發酵中、后期染菌或發酵前期輕微染菌而發現較晚時，可以加入適當地殺菌劑或抗生素以及正常的發酵液，以抑制雜菌的生長速度，也可采取降低培養溫度、降低通風量、停止攪拌、少量補糖等其它措施，進行處理。

2、如果發酵過程的產物代謝已達到一定水平，此時產品的含量若達一定值，只要明確是染菌也可放罐。

3、對于沒有提取價值得發酵液，廢棄前應加熱至120℃以上、保持30min后才能排放。

四、染菌后對設備的處理

染菌后的發酵罐在重新使用前，必須在放罐后進行徹底清洗，空罐加熱滅菌至120℃以上、保持30min后才能使用。也可用甲醛熏蒸或甲醛溶液浸泡12h以上等方法進行處理。

      噬菌體污染及其防治

一、癥狀：發酵液光密度不上升或回降；pH值逐漸上升；氨利用停止；糖耗、溫升緩慢或停止；產生大量泡沫，使發酵液呈粘膠狀；鏡檢時菌體數量顯著減少，甚至找不到完整菌體；發酵周期延長、產物生成量減少或停止等。

二、根源：環境污染噬菌體是造成噬菌體感染的主要根源。

三、防治：嚴禁活菌體排放，切斷噬菌體的“根源”；做好環境衛生，消滅噬菌體與雜菌；嚴防噬菌體與雜菌進入種子罐或發酵罐內；抑制罐內噬菌體的生長；輪換使用菌種或使用抗性菌株。

四、挽救措施

1、盡快提取產品

2、藥物抵抗（如四環素可抵抗乳糖桿菌噬菌體；吐溫60等表面活性劑可抑制噬菌體的增殖和吸附）

3、罐內滅噬菌體法（60-70℃，5min可滅活）